生物安全性越来越受到大家的重视,特别是在食品安全方面。基因工程技术在给人们带来便利的同时,也遇到越来越多的挑战。粟酒裂殖酵母在生物特性方面与高等生物比较相似,但是粟酒裂殖酵母表达系统却一直被人们所忽视。究其原因是因为粟酒裂殖酵母表达载体局限性比较大。本实验室以粟酒裂殖酵母为宿主菌,致力于构建一种新型生物安全性的高效表达载体。我们主要是通过人工设计将生物安全性筛选标记和高效启动子有效融合在同一载体中来实现这一目标。1.寻找粟酒裂殖酵母自身的高表达持家基因。通过分析不同生长时期粟酒裂殖酵母细胞胞内蛋白的SDS-PAGE电泳图,我们发现了一种在各个时期均有较高表达的蛋白。通过传统的硫酸铵分级沉淀方法,我们最终分离到了该高丰度蛋白。通过测定该蛋白N端氨基酸序列们最终比对到一种粟酒裂殖酵母蛋白enolase。该蛋白由439个氨基酸组成,预测分子量为47.3 kD。我们推测该基因的启动子可能为高效组成型启动子。2.对两种组成型启动子eno101启动子和gpd3启动子的长度和转录激活强度进行研究。通过测定在不同长度片段的启动子序列控制下的lacZ酶活,我们最终确定了eno101启动子的长度为276 bp,gpd3启动子的长度为800 bp。同时,我们还发现只有启动子区域有CpG岛和启动子核心序列同时存在时,才能维持持家基因高表达。如果缺少CpG岛时,启动子仍然可以转录激活目标基因,但转录强度会减弱。同时,我们还将这两种启动子与传统的nmtl启动子相比较,来判断这两种启动子的转录效果。通过测定LacZ酶活发现,eno101和gpd3两种启动子的转录强度相差不大,都是nmtl启动子转录激活强度的1.5倍。结果表明这两种组成型启动子在粟酒裂殖酵母中属于强启动子,对我们构建生物安全性高效表达载体具有重要价值。3.人工改造并优化了生物安全性筛选标记基因启动子。我们在来源于粟酒裂殖酵母的gfa基因的启动子序列基础上,人工设计融合了大肠杆菌σ70类型启动子序列。同时,还加入了核糖体结合位点SD序列。在穿梭载体pREP3X的基础上,构建了质粒pGFA-nmt质粒。新构建的质粒pGFA-nmt可在E. coli ΔglmS和S. pombe Δgfal中都能用gfa基因作为筛选标记基因,且不再含有amp和leu基因,达到了生物安全性筛选的目的。质粒pGFA-nmt的长度为7,882 bp,比原来pREP3X的8,784 bp少了900bp,更易于克隆操作。4.构建了两种分别含有eno101和gpd3启动子的生物安全性粟酒裂殖酵母高效表达载体。该载体在大肠杆菌和粟酒裂殖酵母中共用同一个gfa筛选标记基因,不再含有其他筛选标记基因。以本实验室发现的来源于疏棉状嗜热丝孢菌的木聚糖酶xynA基因作为报告基因来验证新构建质粒的实用效果。新构建的质粒pGFA-eno-CX和pGFA-gpd-CX转化酵母后,木聚糖酶XynA在丰富培养基YES和基本培养基EMM中均实现了高效表达,胞外分泌木聚糖酶活最高可达到30 U/ml。