心脏肥大细胞分泌的糜酶是近年发现的一种糜蛋白样的丝氨酸蛋白酶,广泛分布于心肌间质。临床研究显示,糜酶促进了动脉粥样硬化和动脉瘤患者的动脉中血管紧张素2的生成,从而加重了急性心肌梗塞的病情。动物实验证明心脏糜酶直接参与了实验动物的心肌梗死的发病过程,口服糜酶抑制剂(CHI)可明显改善大鼠左室收缩压、舒张末压及平均动脉压等血流动力学参数,降低心肌梗死大鼠的死亡率;同时研究发现,携带人心脏糜酶基因的转基因小鼠催化Angl形成并具有明显的心肌肥厚的趋势,但对于糜酶对加重心肌肥厚的CFs的影响未见报道。研究显示,PI3K-Akt通路是一种重要的内源性心肌肥大调节通路,在促进细胞生长、抑制细胞凋亡、维持细胞生存等过程中具有重要作用。多种研究证实激活心肌PI3K-Akt通路信号途径,可改善心脏收缩舒张功能,并能抑制心肌细胞凋亡,同时内源性的GSK3β因子可以持久性防止心肌肥厚的发生。因此本研究将在细胞水平初步探讨糜酶对CFs增殖和胶原合成的影响;并建立大鼠心梗模型在动物水平探讨糜酶对大鼠心梗后心室重构的作用,并研究相关临床药物对心梗模型糜酶和PI3K-AKt-GSK3β通路的影响,期望进一步阐释糜酶对心肌重构的具体作用机制。方 法1.细胞实验1.1大鼠CFs的制备培养及分组差速贴壁法分离大鼠的成纤维细胞,SABC法免疫组化染色法和台盼蓝染色法鉴定和检测所需的大鼠CFs。将处于对数期生长期的细胞分为对照组(加入无血清DMEM培养液)、糜酶诱导组(将30μg/L糜酶加入到无血清DMEM培养液中)和糜酶抑制剂SBTI干预组(将30μg/L SBTI加入到无血清DMEM培养液中)。用无血清DMEM培养液培养48h,再分别加入培养液、糜酶或SBTI。随后培养24 h,收集细胞用于后续实验。1.2 MTT比色法检测CFs增殖率采用MTT比色法分析比较糜酶对CFs增殖的影响。使用酶联免疫检测仪在490nm处检测上述各组细胞培养后的光密度值(OD值,n=5)。细胞增殖率=OD实验孔/OD对照*100%。1.3流式细胞术分析各组细胞周期采用流式细胞术分析比较糜酶对CFs增殖周期的影响。使用Multicycle(MCYCLE)软件分析细胞所处的周期,并计算增殖指数(PI)。PI=(S+G 2/M)/(GO/G 1+S+G2/M)*100%。1.4 3H-脯氨酸掺入法测定各组细胞总胶原合成采用3H-脯氨酸掺入法分析糜酶对CFs总胶原合成的影响。使用液态闪烁计数仪测定各组细胞放射性强度,所得数据以cpm/孔表示。1.5 RT-PCR法测定各组细胞COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA采用RT-PCR法测定分析糜酶对CFs的COⅡⅠ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA表达的影响。紫外线投射仪下观察各组细胞琼脂糖凝胶电泳条带,分析系统分析目的基因COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ和参比GAPDH基因的条带灰度值。2 动物实验2.1 AMI大鼠模型的制备及分组50只雄性SPF级SD大鼠适应性喂养一周后,随机分成假手术正常对照组、AMI模型组、糜酶抑制剂SBTI干预组、ACEI类药物雷米普利干预组和中成药通络药物芪苈强心胶囊干预组(n=10)。除假手术正常对照组外,其余四组均采用结扎大鼠左冠状动脉的方法建立AMI模型。在心梗发生24h后,连续4周,各组依次每天给予生理盐水、SBTI (10mg/kg,ip)、灌喂雷米普利(10mg/kg,po)、芪苈强心药粉(0.5g/kg,po)。以上各组在术后3天内均使用青霉素抗感治疗,在心梗4周后检测各项指标,颈椎脱臼处死大鼠,随即取出心脏用于后续实验分析。2.2各组大鼠心功能及左心室重量指数(LVWI)测定在心梗4周末处死前,进行心脏形态和功能学检测。测量指标包括左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室内径缩短率(LVFS)、左心室射血分数(LVEF)、左室后壁厚度(PWT)。称量各组大鼠体重(Body Weight,BW),处死大鼠,迅速取出心脏,称量左心室重量(Left Ventricular Weight,LVW)并计算左室重量指数(LVWI=LVW/BW*100%)。2.3各组大鼠心肌病理分析采用HE及Masson染色法测定各组大鼠心肌病理结果。根据染色结果进行各组大鼠心肌病理学评分以及计算胶原纤维容积积分(CV,心肌胶原面积/所测视野面积)。2.4免疫组化法测定心肌组织COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原蛋白以及p-PI3K、p-Akt蛋白表达量采用免疫组织化学法检测各组大鼠心肌组织中COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原蛋白含量及p-PI3K、p-Akt蛋白。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对每张切片选取的视野图片的阳性区域进行定量灰度值测定。2.5 RT-PCR法测定心肌组织COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA采用实时荧光定量PCR法检测各组大鼠心肌组织COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA的表达。紫外线投射仪下观察各组细胞琼脂糖凝胶电泳条带,分析系统分析目的基因COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ和参比GAPDH基因的条带灰度值。2.6免疫组化法测定心肌组织p-PI3K、p-Akt蛋白表达量采用免疫组织化学法检测各组大鼠心肌组织中p-PI3K、p-Akt蛋白。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对每张切片选取的视野图片的阳性区域进行定量灰度值测定。2.7蛋白印记法检测大鼠心肌组织中GSK3β蛋白的表达采用蛋白印记法检测大鼠心肌组织中GSK3β蛋白的表达。采用Image-QuaNT软件测量其光密度,以各β-actin为内参,计算各组蛋白相对光密度值。3 统计学处理采用SPSS 21.0进行统计分析,计量资料采用均数±标准差(xs)表示,多组间均数比较采用one-way ANOVA检验,两两比较采用LSD-t检验;P<0.05则认为具有统计学差异。结果1.细胞实验结果1.1糜酶对CFs增殖的影响与对照组比较,糜酶诱导组的OD值及增值率显著增加(P<0.05),但糜酶抑制剂SBTI的干预则显著降低了 CFs的OD值及其增值率(P<0.05)。以上结果表明:糜酶显著促进了大鼠CFs细胞的增殖,而糜酶抑制剂SBTI则显著抑制了大鼠CFs细胞的增殖。1.2糜酶对CFs增殖周期的影响与对照组比较,糜酶诱导组G0/G1期细胞占比显著降低,S期细胞占比及细胞增殖指数显著升高(P<0.05);SBTI干预组G0/G1期细胞占比显著升高,S期细胞占比及细胞增殖指数显著降低(P<0.05)。与糜酶诱导组比较,SBTI干预组细胞处于G0/G1期细胞同样显著增加,S期细胞占比及细胞增殖指数同样显著降低(P<0.05)。上述结果表明,糜酶显著降低了处于G0/G1期CFs细胞,升高了处于S期细胞占比,显著升高了 CFs细胞的增殖指数。1.3糜酶对CFs总胶原合成的影响与对照组比较,糜酶诱导组3H-脯氨酸掺入量显著增加(P<0.01),SBTI干预组3H-脯氨酸掺入量显著降低(P<0.0 1)。与糜酶诱导组比较,SBTI干预组3H-脯氨酸掺入量亦显著降低(P<0.01)。上述结果表明,糜酶显著增加了 CFs细胞总胶原合成量的表达。1.4糜酶对CFs COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA表达的影响与对照组比较,糜酶诱导组的CFs的COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA相对表达量均显著增加(P<0.05);SBTI抑制组COⅡ-Ⅲ胶原mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),COⅡ-Ⅰ胶原mRNA相对表达量无显著的统计学差异(P>0.05)。与糜酶诱导组比较,SBTI抑制组的CFs的COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA相对表达量均显著降低(P<0.05)。以上结果说明,糜酶显著增加了 COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA的表达量,促进了胶原的合成。2动物实验结果2.1糜酶对各组大鼠心脏超声指标的影响与假手术对照组比较,AMI模型组、SBTI干预组、雷米普利组及芪苈强心组的LVEDD、LVESD与PWT均显著升高(P<0.05),LVEF与LVFS显著降低(P<0.01)。与AMI模型组比较,糜酶抑制剂SBTI干预组、雷米普利组及芪苈强心组的LVEDd、LVESD与PWT均显著降低(P<0.05),LVEF与LVFS显著升高(P<0.01)。与糜酶抑制剂SBTI干预组比较,雷米普利组的LVEDd、LVESD、PWT、LVEF与LVFS均无显著的统计学差异(P>0.05);芪苈强心组的LVEDd、LVESD与PWT均无统计学差异,但LVEF与LVFS显著降低(P<0.01)。以上结果表明,大鼠急性心梗后4周各项心功能指标均显著性下降,而糜酶抑制剂及雷米普利和芪苈强心药物干预则显著改善了大鼠急性心梗后的心功能,同时糜酶抑制剂在改善心梗大鼠心功能指标方面与雷米普利和芪苈强心等药物无显著的差异。2.2糜酶对各组大鼠左室重量指数的影响与假手术对照组比较,AMI模型组和芪苈强心组的LVWI显著升高(P<0.05),糜酶抑制剂SBTI干预组和雷米普利组的LVWI均无显著的统计学差异(P>0.05)。与AMI模型组比较,糜酶抑制剂SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组的LVWI显著降低(P<0.05)。糜酶抑制剂SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组三组间的LVWI均无显著的统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,大鼠急性心梗后4周左室重量指数显著增加,而糜酶抑制剂SBTI及雷米普利和芪苈强心等药物干预则显著降低了大鼠左室重量指数,并且SBTI在降低了大鼠左室重量指数方面与雷米普利和芪苈强心等药物无显著差异。因此糜酶抑制剂及雷米普利和芪苈强心等药物显著改善了急性心梗诱导的心室重构,糜酶在心肌梗死诱导的心室重构过程中有显著的促进作用。2.3糜酶对各组大鼠心肌HE染色病理结果的影响与假手术正常组比较,AMI模型组、SBTI干预组、雷米普利组及芪苈强心组的HE病理评分均显著升高(P<0.05)。与AMI模型组比较,SBTI干预组、雷米普利组及芪苈强心组的HE病理评分均显著降低(P<0.05)。与SBTI干预组比较,芪苈强心组的HE病理评分显著升高(P<0.05),但SBTI干预组与雷米普利组两组的HE病理评分无显著的统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,大鼠急性心梗后4周心肌损伤较为明显,而糜酶抑制剂SBTI及雷米普利和芪苈强心等药物干预则显著降低了心肌损伤程度,并且SBTI在保护心、肌方面与雷米普利无显著差异。因此糜酶抑制剂及雷米普利和芪苈强心等药物显著改善了急性心梗诱导的心肌损伤,糜酶在心肌梗死诱导的心肌损伤过程中有显著的促进作用。2.4糜酶对各组大鼠心肌Masson染色病理结果的影响与假手术正常组比较,AMI模型组、SBTI干预组、雷米普利组及芪苈强心组的Masson染色阳性百分比均显著升高(P<0.05)。与AMI模型组比较,SBTI干预组、雷米普利组及芪苈强心组的Masson染色阳性百分比均显著降低(P<0.05)。与雷米普利组比较,SBTI干预组与芪苈强心组的Masson染色阳性面积百分比均显著升高(P<0.05)。SBTI干预组与芪苈强心组两组间的Masson染色阳性面积百分比无显著的统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,大鼠急性心梗后心室重构诱导的心肌纤维增生明显,糜酶抑制剂显著改善了急性心梗诱导的纤维增生,糜酶在心肌梗死诱导的胶原纤维沉积过程中有显著的促进作用。2.5糜酶对各组大鼠心肌组织COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原蛋白含量的影响与假手术对照组比较,AMI模型组大鼠、SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组大鼠胶原蛋白表达量显著增多(P<0.05)、COⅡ-Ⅰ/Ⅲ胶原比值也显著增加(P<0.05)。与AMI模型组大鼠比较,SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组大鼠胶原蛋白表达量显著降低(P<0.05)、COⅡ-Ⅰ/Ⅲ胶原比值也显著降低(P<0.05)。SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组三组间大鼠胶原蛋白表达量和COⅡ-Ⅰ/Ⅲ胶原比值无显著的统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,鼠急性心梗后心室重构诱导的胶原蛋白表达量明显增加,糜酶抑制剂显著抑制了急性心梗诱导的心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,糜酶在心肌梗死诱导的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的过程中有显著的促进作用。2.6糜酶对各组大鼠心肌组织COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA表达的影响与假手术对照组比较,AMI模型组大鼠、SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组大鼠COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA的表达量显著增多(P<0.05)。与AMI模型组大鼠比较,SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组大鼠COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA的表达量显著降低(P<0.05)。与雷米普利药物干预组相比,SBTI干预组和芪苈强心药物干预组大鼠COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA的表达量显著增加(P<0.05),但SBTI干预组和芪苈强心药物干预组两组大鼠间COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA的表达量无显著的统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,大鼠急性心梗后心室重构诱导的胶原蛋白mRNA表达量明显增加,糜酶抑制剂显著抑制了急性心梗诱导的心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达,糜酶在心肌梗死诱导的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达的过程中有显著的促进作用。2.7糜酶对各组大鼠心肌组织中p-PI3K、p-Akt蛋白的相对表达量的影响AMI模型组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量较对照组显著增加(P<0.01);SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组较AMI模型组的p-PI3K、p-Akt蛋白表达量显著减少(P<0.01)。与芪苈强心药物干预组比较,SBTI干预组及雷米普利干预组p-PI3K蛋白的表达显著降低(P<0.05)。芪苈强心药物干预组、SBTI干预组及雷米普利干预组三组间p-Akt蛋白的表达无显著的统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,大鼠急性心梗后心室重构显著诱导p-PI3K及p-Akt蛋白的表达,糜酶抑制剂显著抑制了 PI3K-AKt-GSK3β通路中PI3K及Akt蛋白的磷酸化水平。2.8糜酶对各组大鼠心肌组织中GSK3β蛋白相对表达量的影响统计学结果显示,与假手术对照组比较,AMI模型组、SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组GSK3β相对表达量均显著降低(P<0.05)。与AMI模型组比较,SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组GSK3β相对表达量均显著升高(P<0.05),但SBTI干预组及雷米普利和芪苈强心药物干预组三组间GSK3β蛋白相对表达量无显著的统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,大鼠急性心梗后心室重构显著抑制了 GSK3β蛋白的表达,糜酶抑制剂显著诱导了 PI3K-AKt-GSK3β通路中GSK3β蛋白的表达水平。结 论1.糜酶显著促进了大鼠CFs细胞的增殖,降低了处于G0/G1期CFs细胞,升高了处于S期细胞占比,显著升高了 CFs细胞的增殖指数;2.糜酶显著增加了 CFs细胞总胶原蛋白合成量及COⅡ-Ⅰ、COⅡ-Ⅲ胶原mRNA的表达量,促进了 CFs胶原的合成。3.糜酶抑制剂SBTI及雷米普利和芪苈强心干预显著改善了大鼠急性心梗后的心功能,降低了大鼠左室重量指数,改善了急性心梗诱导的心肌损伤及纤维增生。4.糜酶抑制剂SBTI及雷米普利和芪苈强心干预显著抑制了急性心梗诱导的心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及mRNA的表达,并且显著抑制了 PI3K-AKt-GSK3β通路中GSK3β蛋白的表达以及PI3K、Akt蛋白的磷酸化。