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目的:糖尿病血管病变是以动脉粥样硬化为主要特征,目前动脉粥样硬化发病机制尚未完全清晰,其与糖脂异常、氧化应激有着密切联系。糖尿病时,机体处于氧化应激状态,其脂质过氧化产物增多,细胞抗氧化能力下降,导致糖脂代谢异常,血脂水平升高,血管壁脂质过氧化导致ox-LDL的生成,巨噬细胞吞噬过多的ox-LDL泡沫化的过程中伴随一系列反应,最终导致血管病变,即动脉粥样硬化。临床上大部分糖尿病患者合并有高血压或血脂异常,故本实验以连梅颗粒为研究对象,开展对粥样硬化机制的研究。由于抗氧化剂有助于治疗粥样硬化且总糖、总多酚、总蛋白、总皂苷等为抗氧化物质主要成分,本实验首先分析测定连梅颗粒中总糖、总多酚、总蛋白、总皂苷的含量,初步评价其体外抗氧化活性:在前期对连梅颗粒成分及其氧化活性的基础上,构建氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞RAW264.7泡沫化细胞模型,探讨连梅颗粒含药血清对氧化型低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响及其抗动脉粥样硬化的可能机制。方法:1.采用苯酚硫酸法测总糖含量,Folin-Ciocalteu试剂比色法测总多酚含量,考马斯亮蓝染料法测总蛋白含量,薯蓣皂苷元法比色测总皂苷含量。通过建立超氧阴离子自由基(02一.)体系、羟自由基(·OH)体系及1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(1,l-dipheny1-2-picrylhydrazyl,DPPH·)体系和还原力体系,以抗坏血酸(VC)作为对照,研究连梅颗粒体外抗氧化活性。2.以油红O染色的方法,观察氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞RAW264.7泡沫化程度,建立氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞RAW264.7泡沫化模型。以MTT法检测细胞生长活性,探讨ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化的合适浓度。3.以SPF级大鼠制备不同浓度的连梅颗粒含药血清,探究不同浓度连梅颗粒含药血清对细胞的影响,选择合适的血清给药浓度。RAW264.7巨噬细胞培养并实验分为6组:①空白对照组(完全培养液)、②模型组(完全培养液+80μg/mL ox-LDL)、③空白血清组(20%空白血清+80μg/mL ox-LDL)、④连梅含药血清低剂量组(20%连梅含药血清低剂量+80μg/mL ox-LDL)、⑤连梅含药血清中剂量组(20%连梅含药血清中剂量+80μg/mL ox-LDL)、⑥连梅含药血清高剂量组(20%连梅含药血清高剂量+80μg/mL ox-LDL)。将各组含药血清作用于ox-LDL诱导的RAW264.7细胞,用油红O染色法观察细胞泡沫化程度,通过RT-PCR、Western Blot法检测B族Ⅰ类清道夫受体(SR-B1)及CD36mRNA和蛋白表达情况。结果:1.连梅颗粒中总糖、总多酚、总蛋白、总皂苷含量分别为396.29、61.04、11.81、354.17mg/g;连梅颗粒铁还原力较强,清除DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基的IC50值分别为0.16、0.59、4.36mg/mL。研究结果提示连梅颗粒具有较强的还原能力,且抗氧化活性大小与其浓度有明显的量效关系。2.ox-LDL MTT实验显示RAW264.7巨噬细胞生长随着ox-LDL浓度升高和时间的延长逐渐受到抑制,12、24、48h的细胞抑制率IC20分别为66.59、79.11、49.53μg/mL,选择80μg/mL ox-LDL作用24 h构建细胞模型,此时油红O结果脂粒适中,细胞形态良好。3.用SPF级大鼠成功制备低、中、高剂量连梅颗粒含药血清。连梅颗粒含药血清MTT实验显示随着血清浓度的升高,RAW264.7巨噬细胞生长逐渐受到抑制,连梅颗粒含药血清空白血清组、低剂量组、中剂量组和高剂量组IC50分别为22.37%、78.61%、46.03%和56.18%,应选择20%作为连梅颗粒含药血清给药浓度。4.油红O结果显示,模型组、连梅颗粒含药血清空白血清组细胞内出现了大量红色脂滴,空白组出现少量的红色脂滴,连梅颗粒含药血清低、中、高剂量组的红色脂滴相比模型组较少,并且随浓度的增加红色脂滴的数量逐渐减少,连梅颗粒含药血清高剂量组红色脂滴有明显减少。5.RT-PCR检测结果显示连梅颗粒含药血清组SR-B1的mRNA表达量与空白组和模型组均有明显升高(P<0.01),连梅颗粒含药血清低剂量组SR-B1的mRNA表达量与空白血清组比较略有升高,无统计学意义。而连梅颗粒含药血清中、高剂量组SR-B1的mRNA表达量明显高于空白血清组(P<0.01);连梅颗粒连梅颗粒含药血清组CD36的mRNA表达量与空白组均有明显升高(P<0.01),但与模型组相比均有略微下降,连梅颗粒含药血清高剂量组与模型组具有显著差异(P<0.01),连梅颗粒含药血清低、中剂量组与模型组无明显差异。6.Western-Blot检测结果显示连梅颗粒含药血清组SR-B1的蛋白表达量显著的高于空白组(P<0.05),其中,高剂量组较空白组明显增高(P<0.01);连梅颗粒含药血清组SR-B1的蛋白表达量略高于模型组,无统计学意义。连梅颗粒含药血清高组SR-B1的蛋白表达量明显高于空白血清组(P<0.01),其中剂量高于空白血清组(P<0.05),其低剂量组略高于空白血清组,无统计学意义。连梅颗粒含药血清低剂量组CD36的蛋白表达量显著高于空白组(P<0.01),连梅颗粒含药血清中剂量组CD36的蛋白表达量高于空白组(P<0.05),连梅颗粒含药血清高剂量组CD36的蛋白表达量略高于空白组,但无统计学差异。连梅颗粒含药血清中、高剂量组CD36的蛋白表达量均显著低于模型组(P<0.01),连梅颗粒含药血清低剂量组CD36的蛋白表达量略低于模型组,无统计学差异。连梅颗粒含药血清高剂量组CD36的蛋白表达量明显低于空白血清组(P<0.01),其中剂量低于空白血清组(P<0.05),其低剂量组略低于空白血清组,但无统计学意义。结论:1.连梅颗粒具有较强的抗氧化能力,可能为其抗动脉粥样硬化提供依据。2.ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化效果显著,可作为一种较为简便的模型制作方法。3.连梅颗粒含药血清可抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化,发挥抗动脉粥样硬化的作用,该作用可能与连梅颗粒含药血清调节SR-B1及CD36的表达有关。