研究背景和目的：心力衰竭(Heart Failure, HF)是由任何原因引起心肌结构和功能的变化,导致心室充盈和射血的障碍而引起的一组临床综合征。在发达国家,心力衰竭患病率约为1%-2%,70岁以上人群的患病率则提升至10%,是导致入院和死亡的头号病因。对心力衰竭发病机制的研究,经历了血液动力学紊乱、神经内分泌激活及分子生物学调节异常等阶段,临床治疗也取得明显进展,但其5年死亡率仍高达50%。近年来,相关研究证实心力衰竭时心脏基因表达发生了明显变化,一些胚胎基因在心力衰竭心脏中出现了表达。MicroRNA (miRNA, miR)是一类新近发现的内源性小分子非编码单链RNA,通过与靶mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)特异性结合,促进靶mRNA降解,或者抑制靶mRNA翻译,降低编码蛋白质水平,从而实现对基因转录后的表达调控。MicroRNA与机体的多种疾病联系紧密,包括神经退行性疾病、糖尿病、肾病以及肿瘤等。近年来的研究发现,miRNA在心脏的生成、发育和功能方面均有着重要作用。有研究表明在小鼠心脏特异性敲除Dicer酶后阻断miRNA的成熟,会导致心力衰竭的发生,提示miRNA在心脏功能的调控中有重要地位。而在胸主动脉缩窄(transverse aortic constriction, TAC)诱导的心肌肥大小鼠及神经钙蛋白转基因小鼠中有21种miRNAs表达上调,7种miRNAs下调。在心肌细胞过表达这些上调或下调的miRNA,心肌细胞发生肥大或体积减小,揭示了miRNA在心肌肥厚、心室重构等病理过程中的重要角色。芯片研究发现心力衰竭心脏与胚胎心脏的基因表达有高度一致性,与正常成人心脏比较,心力衰竭患者心脏有353／677个异常表达的mRNA,而心力衰竭患者心脏表达异常的miRNA中约85%与人胚胎心脏表达异常的miRNA相同；并且心力衰竭组上调的mRNA中含有下调miRNA的结合位点,反之亦然。这提示miRNA可能通过调节大量胚胎基因mRNA的表达作用于心力衰竭。应用人全基因组芯片获得的50例心力衰竭患者心肌miRNA表达谱中有8个miRNA异常表达,应用Ingenuity路径分析(Ingenuity Pathways Analysis, IPA)软件对这8个miRNA的1785个靶点进行再分析,提示这些靶点涉及了细胞信号系统、基因表达和细胞死亡等通路。网络合并分析后鉴定出的多个节点分子大多数是上述miRNAs的靶点,因此提示在心力衰竭中miRNA可能参与了众多蛋白质表达,并且有希望作为潜在的治疗学靶点。既然miRNA在心力衰竭过程中起到了重要的作用,那么其作用的具体分子机制又是什么?能否根据这些作用机制提出新的治疗靶点和方案?目前这些问题尚未有答案。因此,本文研究了在心力衰竭患者心肌中差异性表达的miRNA,探讨了其作用及机制,并在此基础上提出了新的心力衰竭治疗方案。实验方法：运用芯片检测技术对心力衰竭患者心肌和正常对照心肌分别进行检测,从中挑选出差异性表达的miRNAs,并用real-time PCR方法进行验证。分别在SD大鼠心肌梗死导致的心力衰竭模型、异丙肾上腺素导致的心力衰竭模型和腹主动脉缩窄术导致的心力衰竭模型的心脏中对所挑选的差异性miRNAs利用real-time PCR方法进行验证。在H9c2(2-1)心肌细胞中分别转染差异性表达的miRNAs,检测其对细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响。利用生物信息学软件预测miRNA的作用靶点,将挑选出的预测的靶mRNA的3’UTR区克隆至pMIR-Report载体,运用报告基因技术验证靶点,并利用western-blot技术再次验证靶点。利用我们特有的心肌特异性病毒表达载体recombinant adeno-associated virus vector 9 (rAAV9),将效应miRNA及anti-miR分别包装至病毒表达载体,并检测滴度及转染效率。实验结果：1.人心力衰竭患者心肌组织中差异性表达microRNA的初步筛选和验证。通过Exqion公司miRCURY LNATM microRNA Arrays检测发现：与正常心肌组织相比,心力衰竭患者心肌组织中有28个miRNAs表达上调,3个miRNAs表达下调。从中筛选出hsa-miR-21*、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-519e*及hsa-let-7b等进行进一步的验证工作,通过real-time PCR检测证实了以上miRNAs的差异性表达。并且,采用real-time PCR技术对不同原因(心肌梗死、腹主动脉缩窄术后、异丙肾上腺素刺激)导致的SD大鼠心力衰竭模型心肌组织检测以上miRNAs,更进一步证实了芯片结果。2. miR-21*、miR-361-5p、miR-519e*及let-7b心肌细胞的生物学效应H9c2 (2-1)心肌细胞转染以上miRNAs,SRB检测及BrdU增殖实验检测表明miR-21*及miR-519e*明显促进心肌细胞增殖；miR-361-5p及let-7b明显抑制心肌细胞增殖。Annexin V/PI流式检测表明miR-21*及miR-519e*明显抑制心肌细胞凋亡；miR-361-5p及let-7b效应相反。Caspase活性检测进一步表明miR-21*明显抑制caspase-3及caspase-9活性,提示miR-21*可能参与氧化应激作用机制。JC-1、SOD、MDA、T-AOC及CAT检测结果显示,miR-21*参与氧化应激网络。3.miR-21*靶点预测及验证利用MICROCOSM、TARGETSCAN及PICTAR-VERT预测分析网站对miR-21*的作用靶mRNAs进行预测分析,得到883个可能的靶点mRNAs。经过CpG Island、Diseases、Interaction、Expression location、GO、Promoter、Pathway及Transfactor分析后初步选出50条可能的靶点mRNAs进行可行性分析。进而选出19个可能的靶mRNAs进行western-blot检测筛选得到14个可能的靶mRNAs,最后选择6个可能的靶点mRNAs,将其3’UTR区序列构建至pMIR-Report载体,通过荧光报告基因技术检测得到miR-21*的作用靶基因为ACADS、MAN1B1、MYBPC3、NOMO1及WWRT-1.4. rAAV-miR-21*及rAAV-anti-miR-21*病毒包装采用rAAV9包装系统,分别包装rAAV-miR-21*及rAAV-anti-miR-21*病毒,real-time PCR检测病毒滴度,同时转染rAAV-GFP检测转染效率。结论：本实验通过筛选并鉴定人心力衰竭心肌组织中的差异性表达miRNAs,利用分子生物学、细胞生物学技术及生物信息学技术,对miRNA-21*等差异性表达miRNAs在体内、体外对心肌细胞的作用及其机制进行了研究,得出以下结论：1.在人心力衰竭心肌组织中hsa-miR-21*、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-519e*及hsa-let-7b特异性的高表达。2. hsa-miR-21*及hsa-miR-519e*促进心肌细胞增殖,抑制心肌细胞凋亡。3. hsa-miR-361-5p及hsa-let-7b抑制心肌细胞增殖,促进心肌细胞凋亡4. hsa-miR-21*参与心肌细胞氧化应激反应。5.miR-21*通过ACADS、MAN1B1、MYBPC3、NOM01及WWRT-1等信号分子介导在心力衰竭中发挥作用。6. miRNAs可通过rAAV载体介导体内表达,为下一步的基因治疗提供了理论及实践基础。