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家蚕滞育生物钟是依赖卵内酯酶A4(EA4)蛋白的倒计时型生物钟。EA4是最早被确认的具时间间隔测定功能的酶。
根据家蚕EA4测定的氨基酸序列,以3d龄雌蛹脂肪体和卵巢总RNA为模板,利用简并引物RT-PCR方法,得到308bp的部分ea4序列,其1.144nt和145-308nt分别与家蚕2个WGS(AADK01019126.1)5595-5738m和WGS(AADK01014467.1)的8636-8473nt有95%和98%的一致性,根据预测的ea4的cDNA序列,设计特异引物,以雌蛹脂肪体和卵巢RNA为模板,RT-PCR得到的519bp的eDNA序列与预测序列完全一致,并且其推测的氨基酸序列与已知的EA4部分一致性98%,证实获得了ea4全长eDNA。根据预测的ea4DNA序列设计引物,以家蚕全基因组的DNA为模板作PCR,得到WGS(AADK01019126.1)和WGS(AADK01014467.1)之间的拼接序列,最终查清了ea4基因组结构。ea4DNA全长528lbp,有3个外显子和2个内含子,位于家蚕同一条染色体上。
将ea4克隆到具His6序列标签的表达载体pET28a(+),构建大肠杆菌融合表达质粒pET28a(+)-ea4;将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,成功表达了家蚕ea4基因的融合蛋白,为Invitro研究EA4功能奠定了基础。