病理性近视临床上又称为高度近视、恶性近视或变形性近视，是指屈光度在-6.00D以上伴有眼底病理性改变的近视，是难治性致盲眼病之一，严重威胁着人类的健康。其主要有3大特点：1）眼轴延长，2）巩膜异常，3）视网膜、脉络膜及玻璃体变性。病理性近视在病因学上有明显的遗传因素。病理性近视发生发展过程中，巩膜组织作为病变的靶组织会出现变薄、眼轴变长等病理性改变。所以在确定其候选基因时，首先应考虑在巩膜中有较高表达、编码蛋白对维持巩膜正常结构发挥重要作用并位于已知基因位点内的基因。Lumican（LUM）基因定位在MYP3位点内，其所编码的光蛋白聚糖是巩膜细胞外基质的重要组成成分。该蛋白聚糖可以影响胶原纤维的直径和空间的排列，对巩膜的生长及代谢起着重要的调节作用。近视眼巩膜的主动重塑与巩膜细胞外基质的活动明显相关，而巩膜细胞外基质的改变又依赖一些特定的细胞因子。在巩膜的主动重塑的过程中，发现蛋白聚糖及胶原的合成减少，TGF-β表达下降，基质金属蛋白酶（MMp）的活性增加，这些细胞因子的协同作用会影响巩膜细胞外基质的分布，导致巩膜的变薄。本研究通过病例对照研究方法，采用直接测序法分析LUM基因多态性与病理性近视的相关性。再通过Gateway技术构建LUM腺病毒载体转染人胚巩膜成纤维细胞系（HSF），观察LUM对人胚巩膜成纤维细胞的生长及相关基因表达变化的影响。　　第一部分 LUM基因多态性与病理性近视的相关性研究　　目的：探讨LUM基因多态性与病理性近视的相关关系，为进一步研究病理性近视的发病机制奠定基础。　　方法：收集病理性近视患者95例（双眼球镜度数≤-6.0D，眼轴>26mm，且伴有眼底改变）和与之相匹配的正常对照95例（双眼球镜度数在-0.50D～+0.50D之间；间，且眼轴<24mm），通过提取病理性近视组与对照组的血液对LUM基因编码区进行直接测序分析。　　结果：检测到LUM基因编码区的3个单核苷酸多态性（SNP）位点：rs577456426（LUM c.32），rs17853500（LUM c.507）和rs181915277（LUM c.849）。病理性近视组与对照组在LUM基因SNP位点rs17853500的基因型频率和等位基因频率的差异均有统计学意义（P＜0.05）。而两组在SNP位点rs577456426和rs181915277的基因型频率和等位基因频率无明显差异（P＞0.05）。　　结论：LUM基因单核苷酸多态性rs17853500与病理性近视存在关联。　　第二部分 LUM腺病毒载体构建及表达　　目的：构建LUM腺病毒载体后将其转染人胚巩膜成纤维细胞系，为探讨LUM对人胚巩膜成纤维细胞的生长及相关基因表达变化的作用提供实验基础。　　方法：采用Gateway技术构建LUM腺病毒载体。LUM基因的DNA片段经PCR扩增后插入到腺病毒穿梭载体pDown-MCS-/IRES/EGFP上，再将目的基因片段转移到目的载体pAV.Des1d上得到腺病毒质粒，连接产物转化到大肠杆菌Stbl3，菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。再通过感染HEK293细胞对腺病毒进行扩增和包装。设置腺病毒载体pAV.Ex1d-CMV>LUM/IRES/EGFP组、空质粒腺病毒对照组pAV.Ex1d-CMV>EGFP和正常细胞对照组。包装好的腺病毒转染人胚巩膜成纤维细胞系，激光共聚焦显微镜观察转染的效率，再通过PCR及Western blot检测腺病毒载体转染HSF细胞48h后LUM mRNA及蛋白的表达水平。　　结果：腺病毒载体pAV.Ex1d-CMV＞LUM/IRES/EGFP构建成功且测序验证正确。腺病毒转染人胚巩膜成纤维细胞效率为60%。腺病毒转染HSF细胞48小时后，腺病毒载体pAV.Ex1d-CMV＞LUM/IRES/EGFP转染组LUM基因的mRNA和蛋白表达水平明显高于空载体腺病毒pAV.Ex1d-CMV>EGFP组和正常细胞对照组。结论：LUM腺病毒载体pAV.Ex1d-CMV＞LUM/IRES/EGFP能够成功有效的在人胚巩膜成纤维细胞中表达。　　第三部分 LUM过表达对人胚巩膜成纤维细胞影响的研究　　目的：研究LUM腺病毒载体转染人胚巩膜成纤维细胞后对细胞增殖活性的影响，同时检测COL1A1、MMP2、TIMP2和TGF-β表达水平的变化，探讨LUM过表达对人胚巩膜成纤维细胞相关基因的影响。　　方法：人胚巩膜成纤维细胞常规培养分成3组：正常细胞对照组、空质粒腺病毒对照组和LUM腺病毒组，转染1-7天，MTT检测各组细胞增殖情况。细胞转染48小时后，收集各组细胞提取总的的RNA和蛋白，qPCR检测各组细胞中COL1A1、MMP2、TIMP2和TGF-β的mRNA表达情况，Western blot检测各组细胞COL1A1、MMP2、TIMP2和TGF-β的蛋白表达情况。　　结果：MTT结果显示腺病毒载体感染HSF细胞后，各组细胞增殖活性无明显差异（P＞0.05）。HSF细胞转染腺病毒48小时后，qPCR显示LUM腺病毒组MMP2和TGF-β的mRNA表达水平比空白对照组与空质粒腺病毒组明显下降，而TIMP2和COL1A1的mRNA表达水平却增加。Western blot证实LUM腺病毒载体转染HSF细胞后COL1A1、MMP2、TIMP2和TGF-β的蛋白表达变化与其mRNA表达情况一致。　　结论：LUM基因过表达后可通过促进COL1A1和TIMP2表达，抑制MMP2和TGF-β的表达影响巩膜细胞外基质之间的相互作用，在巩膜主动重塑过程中可能具有重要的作用。