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1.研究背景与目的食管癌(esophageal squamous carcinoma, SCC)是最常见的世界上六大恶性肿瘤之一,河南省的林州市(原林县)是中国,也是世界上发病率和死亡率最高的地区。临床上由于缺乏敏感、特异的生物防治和早期诊断的指标和方法,所以首次确诊的SCC患者80%以上均为中、晚期,其5年生存率极低,仅为10%左右,预后非常差。研究表明,肿瘤细胞的侵袭和转移是食管癌复发并导致患者死亡的主要原因。目前,临床医师判断食管癌患者预后的主要指标是组织分化程度和TNM分期。但是,临床上经常发现肿瘤组织分化程度或TNM分期与预后不一致的病例,比如：组织分化程度较高的患者预后并不比分化差的患者好,同一分期的患者预后可能明显不同,提示单纯从形态的改变判断患者预后,存在一定的局限性。影响恶性肿瘤患者预后的重要因素是肿瘤细胞的转移和复发,而肿瘤转移和复发的基础是肿瘤细胞在淋巴结、骨髓、外周血和腹腔中的微转移。肿瘤微转移的检测不仅对判断恶性肿瘤患者复发和预后有重要意义,而且对指导个体化临床的治疗亦有重要价值,因此,如果能在分子水平上探索食管癌侵袭转移相关基因在外周血中的变化,寻找敏感、特异的检测指标,对于食管癌做到“一滴血”早期诊断和早期治疗具有重要的理论意义和临床应用价值。目前临床上缺乏敏感、特异的早期检测食管癌复发和转移的指标。近年有研究利用表面增强激光解析离子化-飞行时间-质谱(surface enhanced laser desorptioninionation-time of flight-mass spectra, SELDI-TOF-MS)技术和比较基因组杂交(comparative genomic hybridization, CGH)技术对来自河南省食管癌高发区的SCC组织进行检测,通过结合分析发现一种叫做YY1的蛋白(即转录因子YinYang1)在同一个体及不同个体食管癌筛选的肿瘤相关候选指标中均有发现,而且YY1蛋白表达与食管鳞癌浸润深度相关,提示该蛋白很有可能与SCC的发生发展有着密切关系。迄今针对YY1mRNA表达与肿瘤的关系少有报道,YY1蛋白属于具转录因子有锌指结构的GLI-Kruppel蛋白家族,YY1蛋白结合位点的破坏可能是病毒逃避宿主细胞监控系统,引起细胞发生转化甚至癌变的重要途径。国内外尚未见有关YY1mRNA表达与SCC关系的报道。本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了54例食管癌患者及25例健康人外周血中YY1mRNA的表达情况,探讨YY1mRNA的表达与SCC的发生发展的关系,进而为从血液中寻找敏感、特异的SCC早期诊断和生物防治的指标和方法提供重要信息。2.材料与方法2.1.病例选择食管癌患者：54例手术治疗食管癌患者均来自食管癌高发区林州市人民医院(2007-2008年),其中女性19例,男性35例(平均年龄54±4.4岁；年龄范围在19-77岁)。患者手术前都未进行任何放疗或化疗治疗。所有患者术后均进行跟踪随访,随访时间均在37周以上。术后73周内死亡的9例患者死因均为肿瘤复发或转移。正常对照组：25例健康人都来自林州市普查人群。其中男性13例,女性12例(平均年龄26±3.2岁；年龄范围在21-49岁)。2.2.外周血和手术切除标本的采集和处理54例食管癌患者均手术当天采集空腹外周静脉血(每人每次5ml)并收集每例食管癌手术切除标本。25例健康受检对象均采集5ml空腹外周静脉血。所有血样均现场分离有核细胞并液氮保存转入实验室-80℃冰箱备用。手术切除标本按本室常规处理(一半固定,一半-80℃保存),固定组织进行常规组织学处理,并进行病理学诊断和TNM分期。冰冻组织进行冰冻切片,HE染色以备总RNA提取。2.3.食管癌组织YY1 mRNA表达检测以HE冰冻切片做模板,提取食管癌组织RNA,利用RT-PCR检测食管癌冰冻组织中YY1 mRNA表达。2.4.食管癌患者和健康人外周血有核细胞YY1mRNA检测采用RT-PCR分别检测正常和食管癌患者外周血有核细胞中YY1 mRNA表达。3结果3.1.病理学检查54例食管癌患者均经病理证实为食管鳞状细胞癌(SCC),其中,高分化7例(12.96%),中分化20例(37.04%),低分化27例(50.00%)；TNM分期：Ⅰ期10例(18.52%),Ⅱa期6例(11.11%),Ⅱb期17例(31.48%),Ⅲ期18例(33.33%),Ⅳ期3例(5.56%)；淋巴结转移阳性39例(72.22%)。3.2.食管癌组织YY1 mRNA表达54例食管癌组织中25例YY1 mRNA表达阳性,阳性率达46.30%(25／54),54例癌旁配对正常组织中,仅5例YY1 mRNA阳性,阳性率为9.26%(5／54)；食管癌组织与配对癌旁正常组织YY1 mRNA检出率差异明显(P<0.05)。3.3.食管癌患者与健康人外周血YY1 mRNA表达54例食管癌患者中有23例外周血YY1 mRNA表达阳性,阳性率为42.59%(23／54)；健康人外周血YY1 mRNA阴性表达,两者相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.4.食管癌患者外周血YY1 mRNA表达根治性手术治疗前,54例食管癌患者中,23例(42.59%)检测有微转移。手术前,食管癌患者外周血微转移、预后与TNM分期和癌细胞分化程度存在密切关系(P<0.05)；Cox风险回归模型分析显示,“细胞分化程度低”、“YY1 mRNA表达”是影响患者生存期的危险因素。3.5.食管癌患者外周血YY1 mRNA表达与相应癌组织YY1 mRNA表达关系外周血微转移阳性的患者,相应的癌组织中均检测到YY1 mRNA阳性,食管癌患者外周血和癌组织中的YY1 mRNA表达具有很高的一致性(P<0.05)。3.6.食管癌患者外周血YY1 mRNA表达和预后的关系食管癌患者外周血YY1 mRNA表达阳性和阴性平均生存期分别为54W(50W-58W)和73W(72W-74W),生存率分别为66%和95%,两组差异有统计学意义(P<0.05)。4.结论4.1.YY1mRNA是食管鳞癌癌变过程中较特异的分子事件,YY1mRNA可作为检测食管鳞癌外周血微转移的敏感性指标。4.2.RT-PCR是检测外周血癌细胞较灵敏和特异分析技术。4.3.检测食管癌外周血Y1mRNA变化可能有助于判断食管鳞癌预后,并通过一滴血对食管癌高发区高危人群早期发现、早期诊断和早期治疗,能够提供有益的探索和理论基础。