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研究背景:临床上有许多具有抗肿瘤作用的中药注射液能增强肿瘤患者的化疗效果,改善临床症状,减轻化疗副作用和免疫调节功能的作用,但有关抗肿瘤作用机制尚待进一步研究。因此,深入研究中药注射液抗癌作用机制,为中药治疗肿瘤提供更多的理论基础,已成为中医药基础研究工作者的首要任务。肿瘤是由某种原因导致人体细胞异常增殖或新生物伴随炎性改变,危害健康扼止生命的疾病。在肿瘤病理生理中,肿瘤细胞对缺氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤之一。肿瘤缺氧是实体瘤常见现象,缺氧可触发机体产生一系列应急性保护反应,使得肿瘤细胞适应缺氧微环境。缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor, HIF-1）是迄今发现的与细胞缺氧有关的最重要的转录因子,它是由HIF1-α亚基与HIF1-β亚基所组成的异二聚体。HIF1-β在细胞内稳定表达不受细胞环境缺氧的影响,而HIF1-a则受缺氧信号的调控。缺氧情况下,HIF1-a在细胞内聚集,与HIF1-β形成异二聚体,进入核内,与其反应元件HRE（hypoxia-responsive-element）结合,启动下游靶基因的表达,靶基因表达产物包括促红细胞生成素、糖酵解的酶类、血管表皮生长因子、转铁蛋白、转铁蛋白受体、血红素氧合酶1等。HIF-1在人类大多数实体瘤中过度表达,与肿瘤细胞适应缺氧,能量代谢,肿瘤血管形成,侵袭和耐药等生理现象密切相关。抑制HIF-1的活性可以增强肿瘤细胞对缺氧的敏感性,降低新生血管的形成及肿瘤细胞的转移。因此,缺氧诱导因子-1可作为潜在的抗肿瘤治疗的靶分子,依此来筛选HIF-1的中药抑制剂,开发具有明确作用靶点和作用机制的中药。高通量细胞筛选是进行药物筛选研究的重要方法之一,目前文献报道多通过氯化钴来构建细胞缺氧模型,因为Co2+离子可替代血红素中的Fe2+,使血红蛋白成为脱氧合状态,从而达到和环境缺氧同样的效果。氯化钴抑制HIF脯氨酰羟化酶对HIF-1α的降解,导致HIF-1α蛋白在细胞内聚集。同时氯化钴抑制了天冬酰氨羟化酶的活性导致HIF-1的转录活性增高（见综述1）。在本实验中我们采用氯化钴化学模拟缺氧。在高通量细胞筛选中荧光素酶报告基因以其简便,快速,灵敏度高等优点被广泛采用。我们构建了HRE-LUC荧光素酶报告基因即将HIF-1的反应元件HRE（Hypoxia responsive element）序列构建到PLUC-MCS荧光素酶报告基因载体的多克隆位点区。海蜃荧光素酶报告基因PRL-TK-LUC（the thymidine kinase promoter-renilla luciferase reporter plasmid）作为内参归一化数据和反映细胞存活情况以及转染效率。将HRE-LUC和PRL-TK-LUC报告基因共转入人宫颈癌细胞系Hela细胞,用氯化钴来化学模拟缺氧后施加药物刺激,然后裂解细胞利用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光值。通过数据分析得出HRE-LUC/PRL-TK-LUC荧光素酶比值即HRE-LUC相对荧光素酶值的变化与药物作用之间的关系,从而判断待筛药物对HIF-1的影响。基于上述理论依据和实验条件我们在氯化钴化学模拟缺氧的情况下利用双荧光素酶报告基因系统筛选四种临床常用中药注射液（艾迪注射液,榄香烯注射液,康莱特注射液,华蟾素注射液）是否具有抑制HRE-LUC表达的作用即是否具有抑制HIF-1活性的作用。为了进一步证明筛选阳性药物对HIF-1蛋白稳定及转录活性的影响,我们用Western blot检测氯化钴诱导缺氧条件下初筛阳性药物对Hela细胞内HIF-1a的蛋白水平的影响,RT-PCR检测氯化钴诱导缺氧条件下初筛阳性药物对HIF-1下游靶基因腺苷酸激酶3的转录水平的影响。研究目的:建立缺氧诱导因子1（HIF-1）的荧光素酶报告基因（HRE-LUC）,在Hela细胞系中建立高通量的缺氧诱导因1抑制剂筛选平台。并在此基础上,研究临床上常用的四种抗癌中药注射液（艾迪注射液,榄香烯注射液,康莱特注射液,华蟾素注射液）在氯化钴化学模拟缺氧条件下对癌细胞系Hela细胞HIF-1的影响。以期发现该四种抗癌中药新的抗癌的分子机制。实验方法:本实验用人宫颈癌Hela细胞系为实验对象,用氯化钴化学模拟缺氧。本实验共分为两部分:第一部分:HRE-LUC报告基因的构建及缺氧模型的建立1 HRE-LUC报告基因的构建将公司合成的3XHRE序列正义链和反义链退火成双链连接到PLUC-MCS空载体上,构建HRE-LUC报告基因质粒,以PRL-TK-LUC作为组成性表达的内参,用于归一化数据和反映细胞存活状况。2缺氧模型的制备氯化钴Co2+离子可替代血红素中的Fe2+,作用与低氧一致,均可使血红蛋白成为脱氧合状态,相当于细胞氧感受器受到低氧刺激。将250μl氯化钴加入常规培养的Hela细胞培养基中继续培养10h即可达到细胞在环境缺氧导致细胞内HIF-1蛋白聚集及转录活性增高的效果。第二部分:高通量药物筛选及初筛阳性药物的进一步验证1四种抗癌中药注射液的筛选:康莱特注射液,榄香烯注射液,艾迪注射液,华蟾素注射液对HRE-LUC荧光素酶表达影响的筛选。将上述四种中药注射液按浓度梯度加入到用氯化钴化学模拟缺氧的并共转染有HRE-LUC和PRL-TK-LUC报告基因的Hela细胞培养基中。一定时间后裂解细胞检测HRE-LUC相对荧光素酶值,通过HRE-LUC相对荧光素酶值的变化来初步确定药物对缺氧诱导因子1的影响。进而筛选出对HIF-1有影响的药物。荧光素酶强度检测（Promega双报告荧光素酶试剂盒及TECAN检测仪）。2 MTT验证初筛阳性药物对Hela细胞生长抑制作用。3 Western blot检测氯化钴诱导缺氧情况下初筛阳性药物不同浓度对Hela细胞内HIF-1α蛋白水平影响。4 RT-PCR检测氯化钴诱导缺氧情况下筛选阳性药物不同浓度对Hela细胞内HIF-1下游靶基因腺苷酸激酶3（AK3）的转录水平的影响。实验结果:我们成功构建了HRE-LUC报告基因,并转入人宫颈癌Hela细胞。在氯化钴诱导下,HRE-LUC相对荧光素酶值表达显著增高（p<0.05）,而没有插入HRE序列的荧光素酶报告基因PLUC-MCS的相对荧光素酶值没有变化（p>0.05）说明我们的化学模拟缺氧模型构建成功。我们筛选到具有益气散结作用的艾迪注射液20ul/100ul培养基,30ul/100ul培养基,40ul/100ul培养基组特异性地抑制HRE-LUC相对荧光素酶值（P<0.05）,且随剂量增加抑制作用增强。MTT结果显示艾迪注射液随着浓度的增大和时间延长明显抑制肿瘤细胞的生长（p<0.05）。Western blot显示艾迪注射液呈剂量依赖性地抑制氯化钴诱导的Hela细胞HIF-1α蛋白聚集。不同剂量的艾迪注射液均有抑制腺苷酸激酶3基因转录的作用。而其它三种中药注射液则对HIF-1的活性没有影响。实验结论:我们建立了基于HIF-1的荧光素酶报告基因高通量药物体外筛选系统。结果发现,具有益气散结作用的艾迪注射液在补益正气改善癌组织氧供增加肿瘤细胞对化疗敏感的同时还抑制肿瘤细胞内的缺氧诱导因子1,进一步提高了对缺氧的敏感性及抑制肿瘤细胞的转移。