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研究目的:1、将链霉亲和素偶联于磁性纳米粒子表面,并表征其性质;2、以牛血清白蛋白（BSA）为载体介导合成生物素化叶酸,并表征其性质;3、建立磁性纳米粒子捕获卵巢癌细胞（SKOV3）模型,验证基于生物素-链霉亲和素介导的磁性纳米粒子磁信号放大系统在低磁场条件下对全血中加标的卵巢癌细胞（SKOV3）的捕获和分离效果;4、验证基于生物素-链霉亲和素介导的磁性纳米粒子磁信号放大系统在卵巢癌患者全血中分离循环肿瘤细胞的效果,评价该方法在实际应用中的可行性。方法:本研究通过共价偶联的方法,将链霉亲和素（SA）偶联在羧基功能化的磁性纳米粒子（MNPs）表面,形成SA-MNPs,并通过琼脂糖凝胶电泳、动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）等手段对偶联SA前后MNPs的物理特性进行了表征分析。采用EDC/NHSS方法,将叶酸（FA）与BSA共价偶联,同时与活泼酯化的生物素反应合成生物素化叶酸（biotin-FA）,使用傅氏转换红外线光谱分析仪（FTIR）对新生成的化学键进行了分析和评价。以EDC/NHSS方法分别将FA、生物素（在BSA的介导下）偶联于MNPs表面得到FA修饰的MNPs（MNPs-FA）和生物素修饰的MNPs（MNPs-biotin）。收集新鲜女性外周全血并分成4组（每组1 m L）,每组按1:10~9/m L的血细胞浓度添加SKOV3细胞建立人体循环肿瘤细胞（CTCs）模型,在磁场（1.0 T）下评价FA-PEG-MNPs、biotin-MNPs、SA-MNPs及基于生物素-SA（biotin-streptavidin system,BAS）介导的MNPs磁信号放大系统（biotin-FA联合SA-MNPs）对卵巢癌细胞（SKOV3）的分离效率,并验证FA对卵巢癌细胞（SKOV3）的靶向性和修饰后减小磁珠的非特异性吸附作用,通过对比FA-PEG-MNPs及基于BAS介导的MNPs磁信号放大系统的分离效率,验证建立方法的高效分离效果。在添加有卵巢癌细胞（SKOV3）的全血模型中,加入一定偶联比的biotin-FA,待其高效识别细胞表面的叶酸受体（FR）后,加入不同偶联比的SA-MNPs,反应完全后,在磁场（1.0 T）下进行分离,通过对比其对卵巢癌细胞（SKOV3）的分离效率选出较佳的SA及MNPs偶联比;同法加入不同偶联比的biotin-FA及择优偶联比的SA-MNPs,选出较佳的生物素及FA-牛血清蛋白偶联比;对比不同反应摩尔比的biotin-FA与SA-MNPs对卵巢癌SKOV3细胞的分离效率选择最佳的biotin-FA及SA-MNPs添加反应量。此外,分别对比不同biotin-FA与细胞反应时间、不同biotin-FA-SKOV3细胞复合物与SA-MNPs反应时间、不同磁分离时间条件下SKOV3细胞的分离效率对实验条件进行优化。通过比较该放大体系在全血、裂解血、磷酸盐缓冲液（PBS）添加卵巢癌SKOV3溶液体系中的分离效率,验证该体系在全血中分离SKOV3细胞的可靠性,并通过对比该体系在添加有SKOV3细胞及A549细胞的全血样本中的分离效率,验证该体系的靶向特异性。将该体系所捕获的SKOV3细胞重置于37℃、5%CO2培养箱中孵育,以验证经磁分离后SKOV3细胞的形态及生物活性改变。将建立的方法用于新鲜卵巢癌患者全血中CTCs的分离,并对捕获的CTCs进行免疫细胞化学染色验证,以评判该方法在实际应用中的可行性。结果:1、TEM显示制备的SA-MNPs呈球形,分散良好且均一,DLS显示其水化粒径分布较集中,平均为（28.53±0.5）nm,相较于未进行修饰的MNPs（平均为25 nm）,其粒径有所增大,偶联有SA后,MNPs的Zeta电位也由（-26.86±1.7）m V增大到（-0.44±0.8）m V;在琼脂糖凝胶电泳中,SA-MNPs的泳动速度略低于MNPs,表明SA-MNPs的成功制备;2、FTIR分析制备的biotin-FA,可见FA的特异性苯环键(峰值为1606 cm-1),同时在1540cm-1和1660 cm-1峰之间,可见属于生物素的新生化学键（N-H键、C-N键和C=O键）;3、在建立MNPs捕获卵巢癌细胞（SKOV3）模型的非特异性实验中,SA-MNPs及biotin-MNPs对卵巢癌细胞（SKOV3）的分离效率明显低于FA-PEG-MNPs和基于BAS介导的MNPs磁信号放大系统,间接表明了FA对卵巢癌细胞（SKOV3）具有一定的靶向性;与FA-PEG-MNPs的分离效率（最高42%）相比,基于BAS介导的MNPs磁信号放大系统73.1±9.54%（N=3）的分离效率有明显较高,表明该放大系统在癌细胞分离检测中的优越性。4、在生物素与FA-牛血清蛋白的偶联比为40:1,SA与MNPs的偶联比为5:1的条件下,biotin-FA以5倍摩尔数的FR在SKOV3细胞表面表达量加入,与SKOV3细胞反应1 h,SA-MNPs以4倍摩尔数的biotin-FA加入反应1 h,在磁场（1.0 T）下分离2 h,基于BAS介导的MNPs磁信号放大系统可实现最大放大,其分离效率可高达94%（91.03±3.5%,N=3）。该放大体系在PBS溶液分离效率高为98±2%（N=3）,裂解血和全血中的分离效率无显著差异,均高为80%左右。将捕获得到的SKOV3细胞置于37℃、5%CO2培养箱中孵育,可见细胞贴壁生长良好。表明该放大系统可实现基本无损伤分离癌细胞。5、在基于BAS介导的MNPs磁信号放大系统的特异性实验中,FA表达阴性的肺癌A549细胞的分离效率（20.55±3.46%,N=3）明显低于对照组卵巢癌细胞（SKOV3）（82.05±4.17%,N=3）。6、在120例实际样本检测中,100例正常女性全血捕获经量子点免疫荧光细胞化学染色后未见明显着色,20例卵巢癌患者中,有16例患者经染色可见绿色荧光。结论:1、制备了性质稳定的SA-MNPs和biotin-FA。2、基于BAS介导的MNPs磁信号放大系统可通过FA和FR的结合特异地靶向卵巢癌细胞（SKOV3）,建立了MNPs捕获卵巢癌细胞（SKOV3）模型。3、基于BAS介导的MNPs磁信号放大系统能无损伤的从女性全血中分离出极微量的加标卵巢癌细胞（SKOV3）,并成功用于卵巢癌患者全血CTCs的分离,在临床应用中有一定的参考价值。