【摘 要】
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由于衰老过程的内在复杂性,人们对揭示衰老的根本原因和相关因素有极大的兴趣。过去的几十年里,科学研究一直试图确定遗传调控和环境变化对衰老的影响。越来越多的证据表明,表观遗传学的改变可以被视为衰老的标志。衰老过程涉及许多表观遗传因素,如组蛋白修饰、DNA甲基化和染色质结构的改变等。组蛋白修饰因子在基因表达和代谢调节过程中起着至关重要的作用,但是有关组蛋白修饰因子是如何调控细胞衰老的相关研究还比较匮乏。
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由于衰老过程的内在复杂性,人们对揭示衰老的根本原因和相关因素有极大的兴趣。过去的几十年里,科学研究一直试图确定遗传调控和环境变化对衰老的影响。越来越多的证据表明,表观遗传学的改变可以被视为衰老的标志。衰老过程涉及许多表观遗传因素,如组蛋白修饰、DNA甲基化和染色质结构的改变等。组蛋白修饰因子在基因表达和代谢调节过程中起着至关重要的作用,但是有关组蛋白修饰因子是如何调控细胞衰老的相关研究还比较匮乏。本研究聚焦组蛋白修饰因子对细胞衰老的影响。以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为模型,对不同衰老程度细胞进行转录组测序分析。从衰老导致下调的2330个基因中筛选得到32个显著变化的组蛋白甲基化修饰酶基因,其中有16个基因的表达量在细胞衰老过程中逐渐下降。通过RNAi干扰抑制16个基因的表达,发现抑制组蛋白甲基转移酶NSD2的表达能够显著促进细胞衰老,并进一步阐明了NSD2影响内皮细胞衰老的作用和机制。具体研究内容与结果如下:1.我们成功分离HUVEC,并在体外进行复制性衰老的传代培养,选取不同衰老程度的P6、P20和P34细胞,对不同代数细胞进行转录组测序。数据分析发现,复制性衰老导致1707个基因上调和2330个基因下调。2.从2330个下调的基因中筛选得到32个显著变化的组蛋白甲基化修饰酶基因,其中有16个是随细胞复制性衰老而逐渐下降的。通过RNAi干扰抑制16个基因的表达,利用SA-β-Gal染色进一步筛选与细胞衰老相关的基因,结果表明内皮细胞敲低NSD2表达导致SA-β-Gal染色阳性率增加63.4%（p<0.001）。3.为了进一步探究NSD2的缺失对细胞衰老的作用。我们发现NSD2的mRNA和蛋白表达量在内皮细胞衰老过程中显著下降（p<0.001）。表明衰老细胞NSD2表达量显著低于年轻细胞。内皮细胞中敲低NSD2表达,显著抑制细胞的增殖能力（p<0.001）、影响细胞周期进程,使部分细胞被阻滞在G0/G1期、导致与细胞衰老相关的异染色质灶（SAHF）阳性细胞率增加57.7%（p<0.001）。体外小管形成实验中,敲低NSD2表达导致体外成管长度降低32.2%（p<0.01）,显著影响血管再生功能。以上结果表明,内皮细胞中敲低NSD2表达能够显著促进细胞衰老。4.为了探究NSD2调控细胞衰老的上游信号通路。通过miRNA预测网站获得8个靶向结合NSD2 mRNA 3’UTR区域的miRNA。检测8个miRNA在不同复制性衰老P6、P20和P34细胞中的表达情况,发现只有miR-34a-5p表达量随细胞复制性衰老次数的增加而逐渐上升。双荧光素酶实验表明miR-34a-5p可以直接靶向NSD2 mRNA 3’UTR区域干扰基因表达。并且后续实验也发现,miR-34a-5p能下调NSD2蛋白表达量47.8%（p=0.049）。过表达miR-34a-5p促进内皮细胞衰老,抑制miR-34a-5p可以延缓内皮细胞衰老。以上结果表明,miR-34a-5p能直接靶向NSD2,通过下调NSD2表达促进内皮细胞衰老。5.为了进一步探究NSD2调控细胞衰老的下游机制。通过检测内皮细胞中敲低NSD2表达或者过表达miR-34a-5p对H3K36me2水平的影响,发现HUEVC敲低NSD2表达或过表达miR-34a-5p都能显著下调H3K36me2的整体水平（p<0.01）。6.通过对内皮细胞中敲低NSD2表达的细胞进行转录组测序,发现敲低NSD2导致604个基因的上调,827个基因的下调。我们将复制性衰老调控的基因与敲低NSD2调控的基因交集分析,发现383个共调控基因,这些基因主要富集在免疫应答通路。综上所述,本研究首次报道敲低组蛋白甲基转移酶NSD2可以促进内皮细胞衰老,并鉴定miR-34a-5p是其上游调控因子;确定miR-34a-5p通过下调基因NSD2降低组蛋白H3K36me2而促进内皮细胞衰老这一新的信号通路轴。本研究为组蛋白修饰因子对内皮细胞衰老的影响提供了依据,为延缓细胞衰老进而实现老年健康提供了新的可干预靶点。
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