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研究目的:血友病甲（HA）的基因治疗,可以克服传统替代疗法的弊端,并且通过构建有较高表达效率的FⅧ表达元件,从而降低转运载体（AAV）的剂量,降低免疫反应,可在一定程度上减少抑制物的形成。关于提高FⅧ的表达效率,除密码子优化策略以外,也有研究表明,不同物种来源的FⅧ,其生物学活性可比人FⅧ（hFⅧ）活性高,然而关于比较大鼠FⅧ（rFⅧ）与hFⅧ活性的研究未见相关报道,并且基于rFⅧ与hFⅧ在核苷酸及氨基酸水平均有较高的同源性（分别为61%、51%）,我们研究的目的是想通过比较rFⅧ与hFⅧ活性差异,通过差异氨基酸替换的方法,对hFⅧ序列进行点突变,进而期望为AAV介导的HA的基因治疗及构建有较高表达效率的FⅧ表达元件提供基础研究数据。研究方法:我们将hFⅧ-BDD-SQ、rFⅧ-BDD SQ、hHC、hLC、rHC、rLC分别克隆到带有CB promoter（泛表达）和ApoE-hAAT promoter（肝脏特异表达）的质粒表达载体中,采取单链策略及HC、LC分开的双链策略,转染293T和HepG2细胞,收转染后指定时间点的培养上清,检测FⅧ的活性（APTT法）及转染上清中FⅧ的抗原表达量（ELISA及Western blot法）。质粒高压注射HA小鼠,取高压注射后指定时间点小鼠外周血血浆样本,进行FⅧ的活性和抗原表达量检测。将ApoE-hAAT promoter携带的hHC、hLC、rHC、rLC分别包装、纯化AAV病毒,按HC:LC=1:1的比例,分为高剂量组(2×1013vg/kg)和中剂量组(8×1012vg/kg),尾静脉注射HA小鼠,每两周采集外周血监测FⅧ在HA小鼠体内的长期表达效果,并评价AAV载体介导的HA基因治疗的安全性。研究结果:我们通过体内外研究发现,rFⅧ活性高于hFⅧ活性。并且,体外细胞转染结果显示,rLC联合hHC能够提高FⅧ的活性,而对FⅧ抗原表达量的影响不大,提高FⅧ比活性约4-5倍;rLC联合hHC提高FⅧ的活性,可排除通过提高转染上清中FⅧ的热稳定性实现,考虑主要受rLC分子本身性质的影响。在体内,HA小鼠高压注射结果显示,rLC能够提高FⅧ的活性和比活性,其比活性提高约4.5倍;AAV病毒携带的hHC、hLC、rLC注入HA小鼠体内,无论是中剂量组还是高剂量组,rLC均能够提高FⅧ的活性,尤其在高剂量组,hHC+rLC与hHC+hLC活性总体具有显著的统计学差异,AAV介导的FⅧ均能够在HA小鼠体内长期表达至36周,且小鼠肝脏功能基本保持正常,在高剂量组有一只小鼠有抑制物产生。研究结论:体内外研究结果提示,rFⅧ活性高于hFⅧ;rLC联合hHC能够提高FⅧ的活性、比活性;AAV介导的FⅧ基因治疗HA小鼠,可使小鼠体内FⅧ长期维持在治疗水平,且总体上,hHC+rLC活性高于hHC+hLC活性;并且rLC与hLC氨基酸序列差异,在提高FⅧ活性、比活性中起主要作用。该研究为AAV介导的HA的基因治疗及构建有着较高表达效率的FⅧ表达元件提供了基础研究数据,也为构建能提高hFⅧ活性的新型FⅧ序列提供了新的选择。