背景慢性肾脏疾病(Choronic kidney disease, CKD)在全球的发病率呈逐渐增加的趋势,且死亡率高。最近的流行病学研究结果显示：急性肾损伤(Acute kidney injury, AKI)在CKD进展到终末期肾病(End stage of renal disease, ESRD)的过程中起重要的作用。AKI加速CKD的发展；CKD的病人则更容易发生AKI。CKD的病人在发生AKI后与非CKD的病人比较,死亡率高,预后差,但相关机制尚不清楚。许多疾病可以导致CKD,如糖尿病(Diabetes mellitus, DM),高血压(Hypertension)和肾小球肾炎(Glomerulonephritis)等,目前DM是导致CKD的一个主要原因。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的最常见、最严重的并发症,其发病原因主要由于长期的高糖刺激,导致一系列代谢和血流动力学的紊乱,最终肾小球毛细血管发生不同程度的硬化,同时伴有肾小球细胞的凋亡和肾小球基底膜的增厚,其病理改变主要集中在肾小球。而缺血再灌注导致的AKI,即急性缺血性肾损伤,其病理改变则主要为急性肾脏小管细胞坏死,特别是近端小管细胞坏死性损伤。糖尿病患者发生缺血性损伤后,与非糖尿病患者比较,肾脏损伤程度重,肾功能差,且肾小管坏死程度重。但是高糖或糖尿病是如何加重缺血诱导的小管细胞死亡的呢?相关机制尚属未知。本文所使用的8周龄Akita糖尿病小鼠具有较高的血糖水平,但糖尿病小鼠肾脏并未有糖尿病肾病的病理改变,因此可以更好的研究高糖状态对小鼠急性肾损伤敏感性的影响。第一部分目的研究糖尿病状态对小鼠缺血性急性肾脏损伤的影响。方法(1)使用血管夹夹闭8-12周龄雄性Akita糖尿病小鼠(DM)和野生型非糖尿病小鼠(ND)的双侧肾动脉,23分钟之后释放血管夹使肾脏再灌注,诱导小鼠急性缺血性肾脏损伤,使用Kaplan-Meier法分析小鼠发生缺血性肾损伤后的生存状况;检测DM小鼠及ND小鼠发生缺血性损伤48小时后的血清肌酐(Scr)水平、尿素氮(BUN)水平；使用HE染色及Tunel染色检测肾脏组织学变化等。(2)分析小鼠血糖水平与血清尿素氮之间的相关关系。结果(1)生存分析结果显示糖尿病小鼠(DM)发生缺血性损伤后死亡率较非糖尿病小鼠(ND)高。肾功能结果显示ND小鼠在缺血性肾损伤发生后0、24、48小时后的血清尿素氮BUN水平分别是25.9±1.13,65.8±18.82,63.1±27.52mg/dl;而DM小鼠BUN水平分别是26.2±3.14,172.6±28.04,244.6±54.22mg/dl,DM小鼠缺血性肾损伤发生后24、48小时BUN水平显著高于ND小鼠(P<0.05)。ND小鼠缺血性肾损伤发生48小时后的血肌酐Scr水平是0.58±0.1mg/dl,而DM小鼠Scr水平为2.29±0.72mg/dl, DM小鼠发生缺血性肾损伤48小时后的Scr水平显著高于ND小鼠(P<0.05)。HE组织学检测显示DM小鼠肾脏损伤指数显著高于ND小鼠(P<0.05)。Tunel染色结果显示肾脏发生缺血性损伤48小时后ND小鼠肾组织小管细胞凋亡水平为38.09±11.75/mm2, DM小鼠小管细胞凋亡水平为119.04±31.07/mm2, DM小鼠缺血性肾损伤后肾小管细胞凋亡水平显著高于ND小鼠肾组织(P<0.05)。(2) Kaplan-Meier分析结果显示小鼠缺血性肾损伤48小时后的BUN水平与小鼠空腹血糖水平呈正相关(R=0.85,P<0.05)。结论糖尿病状态可加重小鼠急性缺血性肾损伤的损伤程度；肾脏损伤程度与小鼠空腹血糖水平呈正相关,提示高血糖水平是糖尿病状态加重小鼠缺血性肾损伤程度的一个重要因素。第二部分目的研究线粒体凋亡通路在高糖或糖尿病加重缺血缺氧诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用。方法(1)肾小管上皮细胞(RPTC)分别在低糖培养基(5.5mM葡萄糖)、高糖培养基(30mM葡萄糖)及甘露醇对照培养基(5.5mM葡萄糖+24.5mM甘露醇)中培养2周之后,使用叠氮钠(Sodium Azide)或无氧(Anoxia)诱导RPTC细胞发生凋亡,检测不同糖浓度处理的RPTC细胞的凋亡水平、Caspase活性等。(2)检测经低糖、高糖处理的RPTC细胞在发生凋亡过程中线粒体凋亡相关蛋白Bax转位及细胞色素c的释放等。(3)分析Akita糖尿病小鼠(DM)和野生型非糖尿病小鼠(ND)发生急性缺血性肾损伤后,肾组织小管细胞Bax蛋白转位、细胞色素c的释放等。结果(1) RPTC细胞经叠氮钠或无氧诱导后发生凋亡,低糖、高糖、甘露醇对照组细胞的凋亡率分别为15%、60%、15%,高糖处理的RPTC细胞的凋亡率显著高于低糖或甘露醇处理的RPTC细胞(P<0.05)。高糖处理的RPTC细胞经叠氮钠Azide或无氧Anoxia诱导发生凋亡后Caspase活性水平分别为79.95±5.08,75.71±3.26nmol AFC/mg/hour;而低糖组RPTC细胞经叠氮钠Azide或无氧Anoxia诱导发生凋亡后Caspase活性水平分别为34.18±3.35,29.83±4.09nmol AFC/mg/hour,高糖组RPTC细胞经诱导凋亡后Caspase活性水平显著高于低糖或甘露醇处理的RPTC细胞(P<0.05)。(2) RPTC细胞经叠氮钠或无氧诱导凋亡的过程中,高糖处理的RPTC细胞经叠氮钠或无氧诱导后Bax蛋白转位,细胞色素c的释放的发生时间要早于,水平要高于低糖或甘露醇处理的RPTC细胞。(3)DM小鼠发生缺血性损伤后,肾组织细胞Bax蛋白转位量,细胞色素c的释放水平要高于ND小鼠。结论高糖或糖尿病通过上调线粒体凋亡通路从而加重缺血缺氧诱导的肾小管上皮细胞凋亡损伤。第三部分目的研究p53在高糖加重缺血缺氧诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用。方法(1)检测p53蛋白在高糖处理的RPTC细胞及糖尿病小鼠肾组织中的表达。(2)稳定转染Dominant Negative p53基因的RPTC细胞(p53-DN)及稳定转染对照质粒的RPTC细胞(Con)在低糖培养基、高糖培养基及甘露醇对照培养基中培养2天,使用叠氮钠或无氧诱导RPTC细胞发生凋亡。检测RPTC细胞经诱导后的凋亡水平、Caspase活性、Bax蛋白转位、细胞色素c的释放等。(3)肾小管上皮细胞(RPTC)在含有p53抑制剂pifithrin-α(20μM)的低糖培养基、高糖培养基及甘露醇对照培养基中培养2天之后,使用叠氮钠或无氧诱导RPTC细胞发生凋亡。检测RPTC细胞经诱导后的凋亡水平、Caspase活性、Bax蛋白转位、细胞色素c的释放等。(4)给予Akita糖尿病小鼠(DM)和野生型非糖尿病小鼠(ND)腹部注射2mg/kg pifithrin-a,30分钟后行双侧肾动脉夹闭术,23分钟后释放血管夹使肾脏再灌注,诱导急性缺血性肾脏损伤,检测肾脏损伤后小鼠生存状况、血清肌酐、尿素氮变化及肾脏组织学变化。结果(1)高糖可以增加体外培养的RPTC细胞p53蛋白的表达,并且诱导p53蛋白Ser15位点的磷酸化;RPTC细胞经Azide诱导发生凋亡后,p53水平升高,高糖组RPTC细胞p53水平显著高于低糖组RPTC细胞。P53蛋白在DM小鼠肾组织中的基础表达稍高于ND小鼠,发生缺血性损伤48小时后,p53蛋白在DM小鼠肾组织中的表达显著升高,在ND小鼠肾组织中的表达则仅轻微升高。(2)使用p53-DN抑制体外培养的RPTC细胞的p53蛋白的活性后,高糖培养的RPTC细胞经Azide诱导的凋亡水平由60%显著降低至15%(P<0.05)；Caspase的活性也由61.63±5.92降至26.76±2.94nmol AFC/mg/hour(P<0.05),同时也可显著抑制Bax蛋白的转位及细胞色素c的释放,提示p53-DN可通过抑制线粒体凋亡通路,从而降低高糖处理的RPTC细胞经ATP耗竭诱导的凋亡水平,但是对低糖处理的RPTC细胞的凋亡水平则无显著影响。(3)使用20μM pifithrin-α抑制体外培养的RPTC细胞的p53蛋白的活性后,高糖培养的RPTC细胞经Azide诱导的凋亡水平由61%显著降低至25.6%(P<0.05); Caspase的活性也由67.73±5.13降至44.83±8.93nmol AFC/mg/hour (P<0.05),同时也可显著抑制Bax蛋白的转位及细胞色素c的释放,提示pifithrin-α是通过抑制线粒体凋亡通路,从而降低高糖处理的RPTC细胞经ATP耗竭诱导的凋亡水平,但是对低糖处理的RPTC细胞的凋亡水平则无显著影响。(4)接受生理盐水注射的DM小鼠在发生缺血性肾损伤48小时后的BUN及Scr水平分别是230.89±45.48mg/dl,2.36±0.56mg/dl,而接受2mg/kg pifithrin-α注射的DM小鼠缺血性损伤48小时后的BUN及Cre水平为100.72±45.27mg/dl,0.83±0.10mg/dl,提示pifithrin-α可显著减轻DM小鼠缺血性肾脏损伤程度(P<0.05),同时结果显示pifithrin-α对ND小鼠的BUN及Scr水平则无显著影响。Tunel染色结果显示接受生理盐水注射的DM小鼠缺血性肾损伤后小管细胞的凋亡水平是131.21±31.07/mm2,接受pifithrin-α注射的DM小鼠的小管细胞凋亡水平是48.32±15.32/mm2,提示pifithrin-α可显著抑制缺血诱导的DM小鼠小管细胞凋亡水平(P<0.05),但对ND小鼠的小管细胞凋亡水平则无显著影响。此外,HE染色结果显示pifithrin-α并不显著降低DM小鼠及ND小鼠的组织损伤水平。结论高糖处理的RPTC细胞或缺血后DM小鼠肾组织细胞的p53蛋白水平要高于低糖处理的RPTC细胞或ND小鼠；使用p53-DN及pifithrin-α、抑制p53蛋白活性可抑制线粒体凋亡通路从而抑制体外高糖培养的RPTC细胞的凋亡水平；pifithrin-α可抑制缺血诱导的DM小鼠小管细胞凋亡水平,减轻肾脏损伤程度,对ND小鼠则无显著影响。总结本课题研究了高糖状态对缺血缺氧性肾脏损伤敏感性的影响,以及线粒体凋亡通路及p53蛋白在其中的作用。研究显示,高糖或糖尿病可加重缺血缺氧性肾脏损伤。高糖处理的RPTC细胞或糖尿病肾组织发生缺血缺氧性损伤后,Bax蛋白转位水平、细胞色素c释放水平、Caspase活性水平及p53蛋白的激活水平要高于低糖处理的RPTC细胞及非糖尿病肾组织。抑制p53蛋白的活性可以有效抑制线粒体凋亡通路,并降低高糖组RPTC细胞及糖尿病小鼠肾组织的发生缺血缺氧性损伤后的损伤水平。提示高糖或糖尿病可通过激活p53蛋白,从而增强线粒体凋亡通路,并加重缺血缺氧性肾脏损伤。