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目的:肺气肿表型是慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）临床表型之一,其发病率和死亡率均高。COPD肺气肿表型患者肺部组织小叶结构受到破坏,严重者稍有活动既有胸闷、气短,严重影响患者生活质量。目前该表型尚无有效药物,因此找到对肺气肿病变进行修复及防止进展的治疗靶点尤为重要。Ⅱ型肺泡上皮细胞（Type II alveolar epithelial cell,AECII）又称为分泌细胞,是肺组织中发挥再生修复功能的“干性细胞”,对肺泡上皮细胞的修复起到重要作用,数量减少,会造成肺泡组织结构和功能受损,课题组前期研究结果证实AECII凋亡增强是肺气肿形成过程中的重要机制之一。PHLDA1（Pleckstrin Homology Like Domain Family A Member 1）属于血小板-白细胞激酶C底物同源（PH）结构域家族,可通过多种途径直接或间接参与机体凋亡调控。课题组前期研究表明肺气肿表型患者细胞凋亡水平升高,体外细胞实验证实PHLDA1在调节ACEII凋亡中发挥抗凋亡作用。PHLDA1在COPD肺气肿组织中蛋白表达水平较对照组减低。本项研究基于上述研究基础上展开,进一步通过体外实验等方法,探讨PHLDA1在COPD肺气肿表型Ⅱ型肺泡上皮细胞表达水平降低的机制。为肺气肿表型患者靶向治疗的实现提供新的策略。研究方法:第一部分:PHLDA1在COPD肺气肿表型中表达水平的研究1.根据患者临床症状、肺功能检查结果筛选出符合条件的COPD患者,根据胸部CT图像结果,将所有受试者被分成COPD非肺气肿表型（COPD nonemphysematous phenotype,COPD-NE）和COPD肺气肿表型（COPD emphysematous phenotype,COPD-E）两组。2.应用GEO（Gene Expression Omnibus database）数据库筛选慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型差异表达基因。3.采用免疫荧光和免疫组化试剂盒比较COPD非肺气肿表型（COPD-NE）组和COPD肺气肿表型（COPD-E）组患者肺组织中PHLDA1的定位及表达水平的差异。4.采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（rt-q PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot）检测PHLDA1在COPD-NE组和COPD-E组中的表达差异。5.人Ⅱ型肺泡上皮细胞系中加入不同浓度放线菌酮（Cycloheximide CHX）,CCK8检测不同时间点、不同浓度的放线菌酮对细胞活力的影响。加入最佳浓度的放线菌酮后,Western Blot检测不同时间点的PHLDA1的蛋白表达量。6.CCK8检测加入不同浓度的蛋白酶体抑制剂Mg132后不同时间点的细胞活力。加入最佳浓度的Mg132后,在最佳时间点通过Western Blot检测PHLDA1的蛋白表达量。7.免疫共沉淀技术检测不同组别细胞中PHLDA1与泛素的结合情况。第二部分:E3连接酶STUB1调控PHLDA1的表达水平1.免疫共沉淀检测人Ⅱ型肺泡上皮细胞系中与PHLDA1相互作用的蛋白,对PHLDA1免疫共沉淀得到的凝胶进行质谱分析,得到具体的相互作用蛋白谱并完成其功能注释,查找与泛素化可能相关的基因。2.应用Ubi Browser数据库,通过生信分析预测PHLDA1的E3连接酶。3.通过Western-Blot及组织免疫荧光验证E3连接酶STUB1在COPD-NE组和COPD-E组的表达差异。通过Western-Blot检测不同组别人Ⅱ型肺泡上皮细胞系中STUB1的表达水平。免疫共沉淀实验验证人II型上皮细胞系中E3连接酶STUB1和PHLDA1是否存在相互作用。4.采用si RNA（small interfering RNA）转染和p EX4质粒转染分别下调及上调STUB1在细胞中的表达水平。敲减和过表达STUB1后通过Western-Blot检测PHLDA1的蛋白表达量。第三部分:Nrf2通过调控PHLDA1错误折叠改善PHLDA1表达水平1.免疫荧光双染技术验证人Ⅱ型肺泡上皮细胞系中不同组别细胞的PHLDA1错误折叠情况。2.免疫荧光双染及Western-Blot验证人不同组别肺组织中Nrf2的蛋白表达量的差异。3.人Ⅱ型肺泡上皮细胞系不同组别细胞中加入Nrf2的激动剂t BHQ后通过Western-Blot检测PHLDA1的蛋白表达量,免疫共沉淀实验验证PHLDA1与Nrf2,STUB1与Nrf2是否存在相互作用。4.人Ⅱ型肺泡上皮细胞系不同组别细胞中加入Nrf2的激动剂t BHQ和抑制剂ML385后再次通过免疫荧光双染检测PHLDA1错误折叠。5.流式细胞术验证人Ⅱ型肺泡上皮细胞系不同组别细胞的凋亡情况。结果:第一部分:PHLDA1在COPD肺气肿表型中表达水平的研究1.GEO数据库分析结果表明PHLDA1是COPD-E组与COPD-NE组的差异表达基因。2.Western Blot、免疫组化及免疫荧光结果表明相较于COPD-NE组,PHLDA1在COPD-E组患者肺组织中低表达,主要表达于人肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞中,且主要定位于细胞浆内。3.Rt-q PCR结果表明较于COPD-NE组,PHLDA1在COPD-E组患者肺组织中表达水平升高,与蛋白表达水平相反。4.放线菌酮实验结果表明香烟烟雾抽提物（CSE）组较对照组相比PHLDA1的降解增加,蛋白质半衰期变短。5.人II型上皮细胞系中加入蛋白酶体抑制剂Mg132后CSE组PHLDA1的蛋白表达量较单纯CSE组明显增加。6.免疫共沉淀实验结果表明CSE组PHLDA1的泛素化程度明显高于对照组。第二部分:E3连接酶STUB1调控PHLDA1的蛋白表达水平1.对人Ⅱ型肺泡上皮细胞系中与PHLDA1相关联的基因进行免疫共沉淀、质谱分析,得到与PHLDA1相互作用的基因2902个,与泛素化可能相关的基因为197个。2.通过生信分析预测PHLDA1的E3连接酶有35个。STUB1为质谱分析和生信分析中共有的基因。推测STUB1为PHLDA1的E3连接酶。3.人肺组织免疫荧光双染结果表明STUB1和PHLDA1可以共定位,STUB1在COPD-E组患者肺组织中高表达。4.Western Blot结果表明相较于COPD-NE组,STUB1在COPD-E组患者肺组织中高表达。人II型上皮细胞系中CSE组STUB1较对照组相比高表达。5.免疫共沉淀实验结果表明人II型上皮细胞系中STUB1和PHLDA1存在相互作用。6.敲减STUB1后PHLDA1的蛋白表达量增加,过表达STUB1后PHLDA1的蛋白表达量减少。第三部分:Nrf2通过调控PHLDA1错误折叠改善PHLDA1蛋白表达水平1.免疫荧光双染结果表明PHLDA1发生错误折叠,CSE组较对照组相比PHLDA1的错误折叠形成增多。2.通过人肺组织免疫荧光双染证实COPD-E组患者肺组织中Nrf2表达减低,PHLDA1和Nrf2可以共定位。Western Blot检测Nrf2在COPD-E组表达下降。人Ⅱ型肺泡上皮细胞中,Western Blot结果表明Nrf2在CSE组细胞中表达下降。3.在人Ⅱ型肺泡上皮细胞中加入Nrf2的激动剂t BHQ,24h后加入6%CSE,Western Blot结果表明加入t BHQ的CSE组较单纯加入CSE组PHLDA1的蛋白表达增加。4.免疫共沉淀结果表明Nrf2和PHLDA1、STUB1可以相互作用。5.CSE组分别加入Nrf2的激动剂t BHQ和抑制剂ML385后,免疫荧光双染结果表明ML385组PHLDA1的错误折叠较t BHQ组增多。6.通过流式细胞术检测不同组别细胞的凋亡情况,结果表明t BHQ可以改善人Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡率。结论:1.PHLDA1主要表达在人Ⅱ型肺泡上皮细胞上。2.COPD-E组PHLDA1蛋白表达量较COPD-NE组下降。3.CSE组PHLDA1蛋白质半衰期变短,主要通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。4.STUB1为PHLDA1的E3连接酶,可以调控PHLDA1的蛋白表达量。5.香烟烟雾抽提物（CSE）导致PHLDA1错误折叠增多。6.上调Nrf2可以减少PHLDA1的错误折叠,减少细胞凋亡。7.PHLDA1、STUB1、Nrf2可能成为COPD肺气肿表型治疗的新靶点。