器官移植是治疗终末期器官疾病的最有效的治疗措施。器官移植可以明显改善患者生活质量,提高生存率,但是移植术后的排斥反应仍是阻碍移植物及移植患者长期生存的主要原因。目前预防和治疗排斥反应的主要手段仍是应用免疫抑制剂,不可否认,强有力的免疫抑制剂是移植成功的基石,目前免疫抑制剂虽能有效的抑制急性排斥反应,但是仍不能从根本上解决移植物的慢性排斥问题,目前临床上应用的免疫抑制剂均没有特异性,在确保移植物成活的同时,也广泛的抑制了机体的免疫力。长期应用免疫抑制剂,增加移植患者感染的风险及恶性肿瘤的发病率,有时这些并发症甚至是致命的。诱导机体对移植物抗原产生特异性免疫耐受,是解决同种异体器官移植排斥反应的最佳方式,既能消除排斥反应,又能摆脱移植患者对免疫抑制药物的终生依赖,有望提高移植患者的生存质量,提高移植物的长期存活率。但是在临床上发生免疫耐受是罕见的,很大程度上可以说是一个偶然的结果。免疫耐受的确切机制目前仍不清楚,摆在移植界及免疫学界的共同难题就是如何才能够成功诱导受者的移植免疫耐受。研究表明免疫耐受可能与T细胞的凋亡、耗竭及调节性T细胞等有关。细胞凋亡是对生命至关重要的一种生理或病理的普遍现象,是细胞按自身程序结束其生命的主动死亡,它不仅在衰老、退化和癌症中起着重要作用,也在移植病理过程中起着重要作用。近些年来,细胞凋亡对免疫系统的调节作用受到重视。越来越多的证据表明,T细胞的凋亡在免疫耐受的诱导及免疫耐受的维护上也发挥着关键作用。研究表明,通过细胞凋亡克隆清除活化的T细胞是移植免疫耐受的一个重要方面。同样,细胞凋亡在自身免疫性疾病中扮演着重要角色,通过观察Fas配体突变和清除缺陷的自身反应性T细胞和B细胞可来识别自身免疫性淋巴组织综合症患者。许多针对凋亡效应T细胞的治疗方法已被证明可以有效的治疗移植和自体免疫疾病。T细胞的耗竭在维护免疫耐受中发挥着关键作用,在治疗自身免疫性疾病及移植排斥中,应用许多不同方法致使效应性T细胞耗竭或凋亡都是有效的。如抗淋巴细胞或抗胸腺细胞球蛋白（ATG）已经被临床使用几十年了,ATG被用来处理各种临床上的情况,例如用于器官移植急性排斥的预防或救护,对异体的干细胞移植和GVHD的条件性处理,严重的再生障碍性贫血和各种自身免疫性疾病的处理。ATG的免疫抑制活性通过补体依赖的溶胞作用或者激活相关的凋亡,导致来自循环池中的外周T淋巴细胞的耗竭。正常免疫系统产生一些T细胞,其主要功能是免疫抑制,命名为调节性T细胞。调节性T细胞在自身免疫和炎症疾病的预防中,在调节病毒性和寄生虫性的感染免疫中,在母源对胎儿耐受维持中以及抗肿瘤免疫抑制中均起着关键的作用。调节性T细胞功能破坏是人类和动物自身免疫疾病和感染性疾病的主要原因。现在发现,任何获得性免疫反应,包括效应T细胞和B细胞的招募和活化,都有调节性T细胞的参与,而且调节性T细胞与效应性T细胞、B细胞的平衡对于免疫反应的强度及免疫耐受的建立都有重要作用。研究发现,调节性T淋巴细胞在免疫耐受的诱导和维持过程中发挥了重要的作用。有文献报道小鼠接受一定剂量放射处理后,调节性T细胞在体外被同种抗原刺激以后将诱导对骨髓和皮肤以及心脏同种移植物的长期的免疫耐受。对调节性T细胞进行足够的预刺激可被用来保护皮肤和心脏移植物免于急性和慢性排斥反应。欧洲的一项关于临床的研究结果发现,相对于发生排斥反应的7例器官移植患者,免疫耐受的5例器官移植患者外周血中CD4+CD25+T淋巴细胞明显升高,Foxp3mRNA表达升高3.5倍,提示外周血调节性T细胞可作为潜在的免疫耐受标志物。随着调节性T细胞特别是CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+Treg）的发现,免疫调节机制在移植耐受中的作用越来越受到重视。Oridonin,是从冬凌草中分离出的一种四环二萜类化合物,由于具有独特生物学特性,已经被广泛地用来治疗感染性疾病。研究表明Oridonin具有抗炎、抗病毒等作用,特别在治疗上呼吸道感染方面。近来有资料显示Oridonin在白血病以及其他肿瘤治疗中具有显著的抑制细胞生长、促进凋亡的作用。Oridonin在食管癌、白血病和黑色素瘤中已经被用作辅助化疗药物。鉴于抗移植免疫排斥药物对机体免疫系统没有特异性,长期服用免疫抑制剂增加感染的几率,并且使感染往往更难以控制,恶性肿瘤的发生率也相应的增加。Oridonin会对机体免疫系统有那些影响?能否将Oridonin用于移植?还没有此类文献的报道。本课题通过体外实验研究Oridonin对细胞的抑制及凋亡,体内实验研究oridonin对外周及中枢T细胞的凋亡与竭,对调节性T细胞的影响,并成功建立同种异基因小鼠皮肤移植模型,通过观察Oridonin对小鼠皮肤移植排斥时间的影响、移植皮肤组织切片淋巴细胞浸润情况等,探讨Oridonin对于免疫系统的作用及机制,为器官移植后形成免疫耐受提供一种新的药物手段。目的观察oridonin对于免疫系统的作用及机制,为器官移植后形成免疫耐受提供一种新的药物手段。方法1.体外实验1.1体外不同浓度oridonin培养BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞CFSE标记后,流式细胞仪检测细胞生长抑制情况。1.2.体外不同浓度oridonin培养BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞,PI和Annexin-V染色后流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞凋亡情况,脾脏中T细胞凋亡情况。2.将BALB/c小鼠随机分为两组,oridonin组和对照组,分别给予腹腔注射oridonin和佐剂。2.1.不同时间点检测两组小鼠外周血单个核细胞总数、流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞总数、T淋巴细胞及单核细胞比例、CD4+T细胞、CD8+T细胞比例变化。2.2.不同时间点检测两组小鼠脾脏单个核细胞总数、流式细胞仪检测脾脏中T淋巴细胞总数、T淋巴细胞及吞噬细胞比例、CD4+T细胞、CD8+T细胞比例变化。2.3.不同时间点检测两组小鼠胸腺单个核细胞总数、流式细胞仪检测胸腺中淋巴细胞总数、CD3+淋巴细胞及CD3+淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞比例变化。3.C57BL/6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体,建立同种异基因小鼠背部皮肤移植模型4.将行皮肤移植后小鼠随机分为三组:oridonin组、环孢素A组、对照组,分别给予腹腔注射oridonin、环孢素A、佐剂,每日测量小鼠体重,观察皮肤移植物排斥时间,不同时间处死小鼠留取血清、流式细胞仪检测小鼠脾脏中调节性T细胞水平变化,取小鼠移植皮片行组织切片观察其病理变化5.ELISA方法检测细胞培养液中以及3组小鼠血清中TGF-β水平统计学方法应用SPSSStatistiCs17.0软件对数据进行统计学处理,根据数据类型不同,小鼠皮肤移植物生存使用Kaplan-Meier绘制方法,小鼠皮肤移植物生存组间的差异用log-ranktest。组间比较用t检验。P<0.05为有统计学意义。所有的数据表示为平均数±标准差。结果1.体外实验Oridonin抑制小鼠脾脏淋巴细胞生长,并且抑制率为浓度剂量-效果依赖形式,半数抑制浓度（IC50）约为2.5μM2.体外实验Oridonin促进小鼠脾脏淋巴细胞凋亡,促进初始的及活化的T细胞凋亡,半数有效浓度（EC50）约为3.5μM,并且为剂量浓度-效应依赖形式,也是时间-效应依赖形式3.体内试验oridonin组小鼠外周血单个核细胞与对照组无明显变化,oridonin组小鼠外周血中T细胞较对照组有明显减少,差异有统计学意义,oridonin组外周血单核细胞比例较对照组增多。4.体内试验早期（8d）,oridonin组小鼠外脾脏细胞与对照组相比,差异无统计学意义,oridonin组小鼠脾脏中T细胞较对照组有明显减少,差异有统计学意义,oridonin组外脾脏中吞噬细胞比例较对照组增多。5.体内试验oridonin组小鼠胸腺细胞总数明显少于对照组,CD3+T细胞比例明显少于对照组,差异均有统计学意义,CD4+、CD8+T细胞较对照组降低更为显著。6.体外实验:低浓度的oridonin能够促使体外TGF-β1表达的上调,高浓度oridonin能够抑制TGF-β1的表达。体内试验:oridonin组小鼠血清中TGF-β1明显高于对照组,环孢素组小鼠血清TGF-β1低于对照组,均有统计学意义。7.Oridonin组小鼠脾脏调节性T细胞明显高于对照组,但是环孢素组小鼠脾脏调节性T细胞明低于对照组。8.Oridonin组小鼠皮肤移植平均排斥时间17天,环孢素A组平均排斥时间为15天,对照组平均排斥时间13.5天,oridonin与环孢素A组相比差异有统计学意义,与对照组相比差异有统计学意义,环孢素A与对照组相比差异无明显统计学意义。9.移植皮肤组织切片示:oridonin组淋巴细胞浸润最轻,环孢素A组次之,对照组淋巴细胞浸润最重,并且高倍镜下每视野淋巴细胞浸润数目oridonin组较对照组差异有统计学意义。10.晚期（18d）,oridonin组小鼠外脾脏体积明显小于对照组,细胞总数少于对照组,oridonin组小鼠脾脏中T细胞较对照组有明显减少,差异有统计学意义,oridonin组第18天小鼠脾脏中吞噬细胞明显少于第8天吞噬细胞,oridonin组外脾脏中吞噬细胞比例较对照组有上调。11.Oridonin组小鼠体重较环孢素A组与对照组均有下降。结论1.Oridonin可以抑制淋巴细胞增殖,促进T细胞凋亡2.oridonin通过促进凋亡、耗尽外周以及中枢T淋巴细胞,上调调节性T细胞表达,诱导同种异基因小鼠皮肤移植免疫耐受能力增强,能够显著延长同种异基因小鼠移植皮肤排斥时间。3.Oridonin副作用小,可能是一种极具应用前景的、可用于移植术后治疗的潜在药物。