协同刺激信号在T细胞参与免疫应答的起始、效应和终止等不同阶段都发挥了重要的调控作用且需要达到相对平衡。PD-1/PD-L途径介导的负性信号能有效抑制T、B细胞功能,在机体免疫应答后期的负性调节中发挥了至关重要的作用,并在肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫和慢性病毒感染等疾病的发生发展中具有重要的生物学意义。PD-1(CD279)为负性协同刺激分子受体,其最显著的特征是胞浆区含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和一个免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)。PD-1主要在活化的T、B和NK等细胞上呈诱导性表达,PD-1有PD-L1(B7-H1,CD274)和PD-L2(B7-DC,CD273)两个配体。PD-L1和PD-L2同属B7超家族,在蛋白结构上均包含有IgV样区、IgC样区、跨膜区和一个短而保守的胞浆区。PD-L1广泛组成性表达于多种实质器官组织、免疫细胞以及多种类型的肿瘤细胞上,而PD-L2仅表达于活化的巨噬细胞、树突状细胞、骨髓来源的基质细胞和个别肿瘤细胞株。研究表明,PD-1随T细胞活化程度逐步上调表达,PD-1/PD-L相互作用后触发ITSM基序募集信号分子SHP-2,引发抑制信号的产生,致使效应性T细胞失能并及时进入凋亡。因此, PD-1/PD-L途径对T细胞在免疫应答过程中恰当而有效的调节具有重要的生物学意义,通过研究PD-1/PD-L与多种临床疾病的相关性,阐明其作用机理,有望为这些疾病的免疫治疗提供新策略。研究发现,多种协同刺激分子能分别以细胞膜型和可溶性两种形式存在,包括CD28、CTLA-4、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3和B7-H4等。可溶性分子可以通过蛋白水解酶裂解细胞上的膜型分子而形成,也可由专一的mRNA直接编码产生。有些可溶性分子具有临床诊断价值。然而,机体中sPD-1、sPD-L1和sPD-L2的表达特性、产生机制及其对膜型PD-1/PD-L抑制途径的调节作用等尚未阐明,这些可溶性因子与临床疾病的相关性和生物学意义尚待研究。本研究旨在构建基因转染细胞L929/PD-1和L929/PD-L1的基础上,进一步研制鼠抗人PD-1和PD-L1单克隆抗体,并对单抗的生物学特性进行研究;分别建立特异性检测人sPD-1和sPD-L1的ELISA方法,并对ELISA检测体系的稳定性和精确性等进行分析、评价;利用sPD-1的ELISA方法对健康人和自身免疫病患者外周血中的sPD-1表达水平及特性进行分析,同时,对sPD-1的产生机制进行研究,探讨该可溶性因子对PD-1/PD-L1途径的调节作用及其在自身免疫病中的生物学意义;应用建立的ELISA分析sPD-L1在人外周血和多种体外培养细胞上清中的表达特性,研究功能性sPD-L1的产生机制及其对T细胞的协同刺激效应,分析肺癌患者外周sPD-L1的表达及其与肿瘤细胞免疫逃逸的相关性。这些研究结果为阐明sPD-1和sPD-L1对PD-1/PD-L1途径的调节作用及其生物学意义提供了新的线索。一、鼠抗人PD-1和PD-L1单克隆抗体的研制及生物学特性的研究【目的】研制特异性鼠抗人PD-1、PD-L1单克隆抗体,为研究人PD-1/PD-L1分子在免疫细胞上的表达特性和探讨该抑制途径对人免疫细胞的生物学效应提供必要的物质材料。【方法】以稳定高表达人PD-1、PD-L1分子的基因转染细胞L929/PD-1、和L929/PD-L1为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以基因转染细胞和融合蛋白通过流式细胞术或ELISA方法筛选杂交瘤细胞培养上清,将鉴定后符合要求的杂交瘤细胞株进行反复筛选和多次克隆化培养,最终获得多株分泌特异性鼠抗人PD-1、PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、单抗/单抗或单抗/蛋白竞争结合抑制实验、Western blot和ELISA等试验,对获得的单克隆抗体进行生物学特性的鉴定;用间接免疫荧光法分析PD-1、PD-L1在不同类型细胞表面的表达特性;应用获得的单抗对人T、DCs等细胞进行体外生物学功能的研究。【结果】成功获得4株稳定分泌鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为9H1、4B9、1F8和8F5,这4株单抗可应用于FACS和Western blot研究,其中4B9和9H1能应用于ELISA的检测分析;竞争抑制实验表明,4株单抗识别的PD-1抗原表位均不同于商品化单抗MIH4,且能识别3个新的抗原表位;单抗9H1能有效阻断PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2的相互结合;体外对T细胞生物学功能的研究结果表明,9H1可逆转PD-L1Ig和PD-L2Ig蛋白对活化T细胞增殖的抑制作用,促进T细胞增殖,且其效应随单抗浓度的增加而趋于增强。利用L929/PD-L1细胞免疫小鼠,经PD-L1Ig蛋白ELISA筛选获得1株特异性鼠抗人PD-L1的单抗(10D7),该单抗识别PD-L1一个新的抗原表位,可应用于FACS、Western blot、ELISA和IP。【结论】成功获得多株新的鼠抗人PD-1、PD-L1单克隆抗体,识别不同抗原表位的单抗为进一步应用于研制ELISA试剂盒,从而用于测定可溶性蛋白因子奠定了良好基础。上述单抗的研制也为揭示膜型PD-1和PD-L1的表达特性,探讨PD-1/PD-L1抑制途径对免疫细胞的调节作用及其生物学意义提供了必要的物质材料。二、特异性检测人可溶性PD-1、PD-L1蛋白ELISA试剂盒的研制【目的】研制特异性高灵敏度检测人sPD-1和sPD-L1的ELISA试剂盒,为定量分析不同来源的临床标本和研究这两种可溶性因子的功能提供有效的检测手段。【方法】利用anti-PD-1 mAb(4B9)作包被抗体在碳酸盐缓冲液中预包被ELISA板,biotin-anti-PD-1 mAb(9H1)作为检测抗体识别与4B9相结合的抗原,再与Streptavidin-HRP反应,最后用TMB底物进行显色反应,建立双抗体夹心sPD-1酶联检测试剂盒。利用相同批次多组检测孔进行精确性分析,利用相同批次ELISA板在不同测定时间点的准确性进行试剂盒稳定性分析。同样的方案,用anti-PD-L1 mAb(2H11)作为包被抗体和biotin-anti-PD-L1 mAb(10D7)作为检测抗体建立特异性检测人sPD-L1的ELISA体系。【结果】成功建立了检测人sPD-1的ELISA体系,该方法能特异性测定人sPD-1蛋白,而与其他蛋白无交叉反应,试剂盒检测的标准曲线在sPD-1蛋白浓度为1.56-100ng/ml区间内呈现良好的线性关系。该方法具有良好的稳定性和精确性,离散度(CV%)分别为<6.24%和<8%。同时,成功建立了特异性检测人sPD-L1的ELISA试剂盒,其检测阈值为0.39-25ng/ml。该检测体系同样具有良好的稳定性和精确性。【结论】特异性高灵敏度检测人sPD-1和sPD-L1 ELISA试剂盒的建立为定量分析PD-1/PD-L1抑制途径中可溶性蛋白因子提供了有效的检测手段。三、sPD-1表达的特性及其对PD-1/PD-L1途径的阻断作用和在自身免疫病理中的意义【目的】揭示健康人外周血中sPD-1表达的特性,阐明机体中sPD-1的产生机制,探讨sPD-1在自身免疫病患者外周异常表达的意义及其对PD-1/PD-L1途径的调节作用。【方法】利用自主研制的sPD-1 ELISA试剂盒检测分析不同年龄段健康人外周血中sPD-1的表达水平;流式细胞术和ELISA分析人T细胞在体外刺激活化过程中膜型和可溶性PD-1的表达特性;通过RT-PCR和TP-PCR法克隆人全长PD-1(flPD-1)、缺失外显子3的PD-1(PD-1Δex3)和PD-1胞外段(sPD-1)基因,构建pIRES2-EGFP/flPD-1、pIRES2-EGFP/PD-1Δex3和pIRES2-EGFP/sPD-1重组真核表达载体,用脂质体法瞬时转染293T细胞,于不同时间点收集基因转染细胞并用免疫荧光标记技术分析细胞膜上PD-1的表达,用Western blot和sPD-1 ELISA方法对各转染细胞培养上清中sPD-1进行定性和定量分析;合成PD-1蛋白胞内段特定的抗原肽,免疫新西兰兔制备兔抗人PD-1胞内段多抗;免疫沉淀技术收集人血清中的sPD-1并进行Western blot,应用兔抗人PD-1胞内段多抗与sPD-1蛋白杂交显色,进而鉴定sPD-1蛋白特性;通过竞争抑制实验分析sPD-1蛋白与PD-L1、PD-L2的结合能力;利用sPD-1 ELISA和Western blot方法对自身免疫病患者(Graves’、RA和HSP)外周血中该因子进行定量和定性分析。【结果】sPD-1 ELISA检测发现,健康人外周血中存在sPD-1,儿童表达水平较低,青年人和老年人的血清中该因子含量没有显著差异;人T细胞在体外刺激活化后膜型PD-1和可溶性PD-1均呈诱导性上调表达;通过重组PCR成功克隆了人PD-1Δex3基因,构建了重组表达载体并转染真核表达细胞;流式细胞术检测结果显示,转染全长PD-1基因的细胞高表达膜型PD-1分子,而PD-1Δex3基因转染细胞表面无PD-1蛋白;对基因转染细胞上清进行ELISA和Western blot的分析结果表明,在PD-1Δex3转染细胞上清中产生高水平的sPD-1蛋白,且PD-1Δex3蛋白能够阻断PD-1/PD-L的相互作用;利用兔抗人PD-1胞内段抗体研究发现,人血清中的sPD-1能被该多抗特异性识别结合,进而表明,人外周血中sPD-1由PD-1Δex3编码产生。研究发现,自身免疫病(Graves’、RA和HSP)患者外周sPD-1表达水平异常升高。【结论】功能性sPD-1存在并高表达于自身免疫病患者外周为进一步阐明sPD-1对PD-1/PD-L1抑制信号的阻断作用开拓了新的途径,为探讨该可溶性因子在生理和自身免疫病理条件下的生物学意义奠定了良好的基础。四、sPD-L1表达的特性及其对PD-1/PD-L1途径促进作用和在肿瘤免疫逃逸中的意义【目的】应用sPD-L1 ELISA揭示健康人外周血和多种体外培养细胞上清中sPD-L1表达的水平和特性,阐明sPD-L1的产生机制,探讨sPD-L1在肿瘤患者外周异常表达的意义及其对PD-1/PD-L1途径的调节作用。【方法】利用自主研制的sPD-L1 ELISA试剂盒检测分析健康人外周血中sPD-L1的表达水平;流式细胞术和ELISA分析人Mo-DCs在体外诱导分化成熟过程中膜型PD-L1(mPD-L1)和可溶性PD-L1(sPD-L1)的表达特性;ELISA法检测分析多种mPD-L1+和mPD-L1-细胞株产生sPD-L1的水平;应用免疫沉淀和Western blot技术鉴定sPD-L1蛋白的分子量;在高表达sPD-L1的L929/PD-L1和Mo-DCs细胞培养体系中加入金属蛋白酶抑制剂(MMPI),于不同时间分析sPD-L1的表达量;通过与PD-1Ig融合蛋白结合实验分析sPD-L1的生物学活性;应用CCK-8掺入法体外研究sPD-L1对T细胞增殖和活化的抑制作用;利用sPD-L1 ELISA分析该因子在肺癌患者外周血中的表达水平,将获得的结果用统计学软件与各项临床指标作相关性分析。【结果】sPD-L1 ELISA检测结果显示,人外周血中存在sPD-L1,且表达水平与年龄呈正相关;在Mo-DCs诱导成熟过程中mPD-L1持续高表达,而sPD-L1的表达量随Mo-DCs成熟显著增加;研究中还发现,在mPD-L1+细胞株的培养上清中高表达sPD-L1,而在mPD-L1-细胞株的培养上清中检测不到;不同细胞产生的sPD-L1蛋白分子量相同,为同一种蛋白形式;金属蛋白酶抑制剂(MMPI)可显著抑制L929/PD-L1和Mo-DCs细胞产生sPD-L1;细胞产生的sPD-L1能与PD-1特异性结合,该可溶性因子可显著抑制抗CD3单抗刺激的T细胞的增殖和活化;肺癌患者外周血中异常高表达sPD-L1,且该因子的表达水平与肿瘤细胞的淋巴结转移密切相关。【结论】人外周血中存在的功能性sPD-L1能促进PD-1/PD-L1负性信号,该因子参与了肿瘤细胞的免疫逃逸,这为研究PD-1/PD-L1靶向免疫治疗提供了实验依据,具有重要的理论研究和潜在的应用价值。综上所述,本论文获得了以下研究结果:(1)研制获得4株新的鼠抗人PD-1单抗和1株新的抗人PD-L1单抗,这些单抗可用于FACS、Western blot、ELISA和IP等研究;功能性anti-PD-1 mAb (9H1)能阻断PD-1/PD-L介导的抑制效应。(2)首次建立了两种特异性检测人sPD-1和sPD-L1的ELISA方法(。3)利用自主研制的sPD-1 ELISA研究发现,健康人外周血中存在sPD-1的表达,在RA、HSP和Graves’等自身免疫病患者外周sPD-1异常高表达。首次证实,PD-1Δex3基因表达产物不位于细胞膜表面而释放至细胞外,且PD-1Δex3蛋白具有良好的生物学活性,人外周sPD-1由PD-1Δex3 mRNA表达产生。(4)首次发现,sPD-L1在人外周存在表达,其水平与年龄呈正相关,成熟Mo-DCs产生高水平sPD-L1;sPD-L1主要由mPD-L1+细胞经金属蛋白酶(MMPs)剪切mPD-L1产生;PD-1/sPD-L1作用后能显著抑制T细胞的增殖和活化;肺癌患者外周异常高表达sPD-L1,其表达水平与肿瘤的淋巴结转移密切相关。