麦胚发酵法和模拟酶法制备甲氧基对苯醌和2,6-二甲氧基对苯醌的研究

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小麦胚芽是小麦加工过程的副产品,富含多种对人体有益的生物活性成分。通过微生物发酵而得的麦胚发酵提取物(FWGE)具有显著的抗肿瘤功效并且已被开发为癌症患者的食疗产品。本课题以小麦胚芽为原料,以发酵麦胚中最为重要的抗肿瘤成分2-甲氧基对苯醌(MBQ)和2,6-二甲氧基对苯醌(DMBQ)为研究对象,通过使用超声辅助法和添加多种大量元素、微量元素和维生素,以提高了发酵麦胚中MBQ和DMBQ的产量为目的,对相关问题展开了系统地研究。之后应用磁性Fe3O4纳米颗粒作为分离纯化载体,对麦胚发酵液中的MBQ和DMBQ进行分离。最后构建一种新型纳米材料模拟酶,研究MBQ和DMBQ的非酶制备方法。全文的主要内容包括以下四个方面:使用制备型高效液相色谱法分离得到MBQ和DMBQ的前体物氢醌糖苷,并通过四级杆飞行时间质谱对组分进行结构鉴定,三种氢醌糖苷分别是:4-羟基-3-甲氧基苯基-β-D-三吡喃葡糖苷,4-羟基-3-甲氧基苯基-β-D-二吡喃葡糖苷,4-羟基-3,5-二甲氧基苯基-β-D-二吡喃葡糖苷。前人文献报道的发酵麦胚中MBQ和DMBQ的含量较低且并未优化过基本发酵条件。此外,针对微生物发酵这一复杂非线性体系难以建模的特点,选择使用人工神经网络(ANN)结合遗传算法(GA)获得超声辅助发酵麦胚制备MBQ和DMBQ的最佳工艺条件。发酵的最佳条件是:摇床转速142 r/min,初始pH6.09,温度31.6℃。针对β-D-糖苷酶多位于酵母细胞胞内和发酵液中过氧化氢含量较低等限制条件,采用超声辅助发酵的方法提高目标物产量,超声最佳条件是:功率74 W,持续时间70 s,起始时间25.2 h。在此条件下MBQ+DMBQ的产量比对照组高65.2%,并且缩短了发酵时间。研究发现间歇性超声通过破壁方式促进了胞内关键酶的释放,并提高了发酵液中过氧化氢的水平,从而促进了氢醌糖苷向MBQ和DMBQ的转化。使用人工神经网络结合遗传算法优化十六种营养素,包括大量元素(Ca,Mg)微量元素(Fe、Cu、Zn、Mn、Se)和维生素(B1、B2、B3、B5、B6、B12、K3、K5、C)的添加方案。MBQ+DMBQ的最大预测值为0.939 mg/g,在此方案下MBQ+DMBQ的实际产量为0.913±0.021 mg/g,比对照组的MBQ+DMBQ高117%。另一方面,通过概率的方式描述单一营养素和目标值之间的变化关系。此外,针对以往文献未有基于人工神经网络评价因素间二阶交互作用的方法的报道,本文基于部分析因设计中评价因素间二阶交互作用的理念,提出了一种以人工神经网络模型为框架、结合Garson算法和偏导数的新的评价因素间二阶交互作用的方法并初步验证。结果表明添加物的相对重要性排序为:Mg×B6>Mg×B2>Fe×B5>Ca×B3>Zn×B3>Mg×B1>Ca×B2>Ca×B12>Cu×B6>Cu×K5>Mg×B12>Ca×K3>Mg×K3>C>Zn×B3。为避免传统分离纯化方法带来的溶剂消耗、成本较高和操作繁琐等不利因素,制备具有高度生物相容性的磁性Fe3O4纳米颗粒对麦胚发酵液中MBQ和DMBQ进行磁性吸附。首先研究Fe3O4纳米颗粒制备条件对麦胚发酵液中的MBQ和DMBQ吸附能力的影响。吸附实验的结果表明磁性Fe3O4纳米颗粒作为吸附载体对MBQ和DMBQ的最大吸附能力可达93.0%以上,同时对发酵液中多种酚酸也有一定的吸附能力,对氨基酸的吸附则与氨基酸的表面电荷有关。解吸实验的结果显示使用水或乙醇溶液可使阿魏酸、香兰酸、对香豆酸的解吸率在84%以上,对MBQ和DMBQ的解吸率则在4%以下。另外,实验结果显示在20%乙酸或超声强化解吸的条件下,MBQ和DMBQ的解吸率分别达到了97.5%和98.1%。磁性Fe3O4纳米颗粒对MBQ和DMBQ的吸附行为符合Langmuir等温吸附方程。向麦胚发酵液中添加浓度范围300-1200 mg/L的纳米颗粒的添加可显著增加MBQ和DMBQ的生成量,最大生成量出现在添加浓度为600 mg/L的实验组中,MBQ和DMBQ(游离的和被纳米颗粒吸附的)总量比对照组高42%。针对发酵法制备MBQ和DMBQ中MBQ和DMBQ产率较低的缺点,使用酸性离子液和Fe3O4纳米颗粒作为模拟酶,以介孔硅分子筛材料MCM-41作为载体构建一种可催化氢醌糖苷生成MBQ和DMBQ的复合催化剂。首先考察四种带有磺酸基基团而阴离子类型不同的Br?nsted酸性离子液催化氢醌糖苷的水解反应。结果表明在相同条件下,催化活性顺序为:[MIMSO3H][HSO4]>[MIMSO3H][Cl]>[MIMSO3H][H2PO4]>[MIMSO3H][BF4]且[MIMSO3H][HSO4]和[MIMSO3H][Cl]的催化活性较为接近。此催化活性排序基本与离子液本身酸度顺序一致。之后将[MIMSO3H][Cl]和[MIMSO3H][HSO4]分别与磁性Fe3O4纳米颗粒固载于MCM-41上。这两种复合材料模拟酶催化4-羟基-3-甲氧基苯基-β-D-二吡喃葡糖苷制备MBQ的最佳条件均为:反应温度60℃,复合剂催化剂和氢醌糖苷的摩尔比1:4,过氧化氢浓度20 mmol/L。在最优催化条件下MBQ的生成率为88.1%(Fe3O4-MCM-41-[MIMSO3H][HSO4])和84.4%(Fe3O4-MCM-41-[MIMSO3H][Cl])。两种复合催化剂重复使用7次后,MBQ产率基本没有降低。
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