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一、研究背景人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)感染可引起HIV-1相关神经认知障碍(HIV-1associated neurocognitive disorders,HAND)。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)可有效降低中枢神经系统(CNS)的HIV-1病毒载量,但轻度和中度HAND仍然普遍存在并影响患者生活质量。共病因素是导致艾滋病患者合并神经系统并发症的原因之一,吸烟是常见因素。烟草的主要成分尼古丁(nicotine,NT)是cα7nAchR(A7R)激动剂,HIV感染患者与gp120转基因小鼠脑部检测到A7R表达上调,其中的具体机制尚不明确。二、研究目的本文旨在探讨尼古丁与gp120共同通过A7R介导神经元凋亡的机制,及A7R抑制剂盐酸美金刚对神经元凋亡的保护作用。为尼古丁与HIV-1共病所引起的患者HAND发病机制提供研究基础,为后续新药开发提供新思路。三、研究方法1、Gp120转基因(Tg)小鼠模型鉴定与繁殖Gp120转基因小鼠于3周时剪取尾部组织提取DNA,通过RT-PCR技术进行鉴定,筛选出gp120阳性小鼠,实验所用小鼠为10-13月龄小鼠。2、Gp120与尼古丁处理小胶质细胞BV2和神经元细胞Gp120与NT、以及A7R抑制剂、激动剂、盐酸美金刚和siRNA处理BV2细胞,收集上清处理神经元细胞,或gp120与NT直接作用于神经元细胞。收集BV2细胞上清以及细胞蛋白。通过蛋白免疫印迹(westernblot,WB)检测P53、Omi、XIAP及Caspase-3蛋白表达水平,通过流式细胞仪观察gp120与NT诱导的ROS激活、神经元细胞凋亡情况。3、Gp120 Tg小鼠腹腔注射NT和MLAGp120Tg小鼠和WT野生鼠分为8组(每组7只):WT+vehicle、WT+MLA、NT、gp120Tg、NT+gp120、NT+MLA、gp120Tg+MLA、NT+gp120+MLA。NT 浓度为1 mg/kg体重,MLA浓度为3mg/kg体重,每只小鼠腹腔注射200ul/每3天,持续60天。四、结果1、Gp120Tg小鼠能稳定表达gp120,数量及月龄能满足实验需求。2、Gp120与NT处理BV2细胞后细胞表达A7R增加,上清引起神经元凋亡增加,抑制剂处理后表达降低。gp120与NT直接作用与神经元时不能引起神经元凋亡,相反抑制剂处理后神经元凋亡增加。3、Gp120与NT处理小鼠后检测到小鼠脑组织皮层与海马组织A7R与Ibα-1表达增加,神经元细胞减少,通过A7R抑制剂处理后Ibα-1表达降低,神经元细胞增加。4、Gp120与NT通过不同的时间梯度与浓度梯度处理BV2细胞,Caspase-3表达呈时间与剂量依赖趋势。共同作用于BV2细胞时检测到细胞中ROS激活增加,p53,Omi,Caspase-3蛋白表达增加,A7R抑制剂以及siRNA处理后表达降低。5、通过盐酸美金刚预处理后gp120与NT诱导的ROS、p53、Omi与Caspase-3表达趋势与A7R抑制剂结果一致。6、通过A7R激动剂处理BV2细胞后,细胞中ROS、p53、Omi与Caspase-3表达降低。五、结论1、Gp120与NT通过gp120+NT-A7R-p53-Caspase-3通路引起神经系统损伤。2、A7R的抑制可降低gp120+NT-A7R-p53-Caspase-3通路的激活和神经系毒性。3、盐酸美金刚可改善gp120与NT所引起的神经毒性作用、认知功能和神经保护。