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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)也称 Aujesky 病,是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种能够感染牲畜和多种野生动物并引起漆痒、发热和脑脊髓炎等症状的急性传染病。猪的伪狂犬病在临床上的主要表现为发病猪只体温升高,新生仔猪有神经症状,育肥猪主要有呼吸道症状,母猪常发生流产,对养猪业危害极大。对该病的防控主要是疫苗免疫和加强生物安全等措施。在2011年底我国华东多地免疫过Bartha-K61疫苗的猪场出现猪伪狂犬病疫情,之后疫情逐步蔓延向全国各地的养猪场,从发病猪场的死亡仔猪中分离到了 PRV的变异毒株,说明Bartha-K61这种传统的弱毒疫苗面对伪狂犬变异毒株已不能提供完全保护力,因此研制出针对变异的伪狂犬病毒的疫苗对我国养猪业是极为迫切和必要的。本研究以PRV的变异毒株PRV AH02LA株构建的BACPRV-G为基础,用En Passant方法,通过同源重组的方式,构建了双基因缺失株PRV △TK&gE-AH02,并对该缺失株的体外生长特性和免疫保护力进行了初步的研究。1伪狂犬病毒TK&gE基因缺失株的构建首先将带有TK基因两侧同源臂的卡那霉素杭性基因电转到B ACPRV-G的感受态细胞中以取代TK基因,构建出BACPRV ATK/gE/gI/Kar+。然后经阿拉伯糖诱导敲除BAC基因组中的卡那霉素抗性基因,构建出BACPRV ATK/gE/gI。扩增转移载体,转移载体与BACPRV △TK/gE/gI基因组DNA 一起转染CEF细胞,在荧光显微镜下观察到未发出荧光的白斑,成功拯救了无mini-F并恢复了 gI基因的双基因缺失重组病毒株,命名为PRV ATK&gE-AH02。PCR产物序列分析显示PRV ATK&gE-AH02在gE基因内部缺失了第1位至第1418位共1418bp,TK基因内部缺失了第184位至530位共347bp。2 PRV △TK&gE-AH02的生长特性研究发现PRV △TK&gE-AH02和强毒株PRV AH02LA在ST细胞上增殖的最高病毒含量分别为106.29TCID50/0.1ml和107.19 TCID50/0.1ml,与亲本株相比,尽管TK和gE基因的双缺失对病毒的增殖有一定的影响,但双缺失株的病毒含量仍然能达到较高的水平。另外还测定了 PRV △TK&gE-AH02和强毒株PRVAH02LA在ST细胞上增殖的生长曲线,在规定时间收取感染细胞上清液和感染细胞中细胞结合性病毒并测定其病毒滴度,测定三次后统计所有时间点病毒液的TCID50,取平均值绘制生长曲线。从病毒生长曲线可以看出,PRV △TK&gE-AH02与强毒株PRV AH02LA的生长特性相似,但是前者的增殖速度比后者要慢,这说明TK和gE双基因的缺失对PRV的体外增殖是有影响的。3 PRV △TK&gE-AH02的安全性及免疫效力研究将PRV △TK&gE-AH02以肌肉注射的方法接种28日龄健康易感猪,接种剂量为106TCID50,同时设Bartha-K61免疫猪为对照,接种剂量相同,所有免疫猪没有出现PR的临床症状。免疫后7天对接种PRV △TK&gE-AH02和免疫Bartha-K61株的试验猪与空白对照猪一起,用强毒株PRV AH02LA攻毒,所有免疫PRV △TK&gE-AH02的猪无任何临床症状,没有检测出排毒,所有猪均得到了完全的保护。而Bartha-K61弱毒苗组在攻毒后体温升高明显并检出有排毒现象。这表明该基因缺失病毒PRV △TK&gE-AH02对猪安全,具有良好的免疫原性,能够保护猪抵御PRV变异强毒株的攻击。