升阳益胃冲剂治疗早期帕金森病的临床与实验研究

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目的:观察升阳益胃冲剂对早期帕金森病(脾肺气虚证)患者的临床疗效,筛选方中对PC-12帕金森病体外细胞模型具备保护作用药物,探索并验证其对帕金森病凋亡相关靶点蛋白表达的影响。方法:(1)收集自2016年1月到2021年2月符合纳入标准的早期帕金森病患者60例,根据是否服用升阳益胃冲剂分为中药试验组与对照组,比较两组患者治疗前、治疗2周后、治疗4周后新版世界运动障碍学会帕金森病综合评量表(Movement Disorder Society-Sponsored Revision Unified Parkinson’s Disease Rating Scale,MDS-UPDRS I&II&III)、帕金森病非运动症状评价量表(Parkinson’s disease Non-Motor Symptoms Scale,NMSS)、疲劳严重度量表(Fatigue Severity Scale,FSS)、改良的Hoehn&Yahr分期等评分变化,采用SPSS23.0进行统计分析,评估临床疗效。(2)使用中药系统药理学数据库(TCMSP)、CD-HIT数据库筛选出升阳益胃冲剂及君药黄芪的候选作用靶点,使用GENECARDS数据库、OMIM数据库中筛选帕金森病相关的疾病靶点,绘制成分-靶点网络,使用STRING数据库构建蛋白互作网络,使用Bioconductor cluster Profiler进行GO(基因本体)富集分析和KEGG(京都百科全书和基因组)通路富集分析。(3)通过CCK8法对升阳益胃冲剂中药物进行筛选,选择其中能够显著促进PC-12帕金森病体外模型细胞存活的药物,结合网络药理学结果,对其相关靶点蛋白表达进行验证。采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法对磷酸化-细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2),ERK1/2,B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax),Bcl-2,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),剪切的Caspase-3(c-Caspase-3)等靶点蛋白表达进行分析。结果:(1)治疗前后MDS-UPDRS I部分、MDS-UPDRS总分、NMSS总分、NMSS心血管系统项目评分、NMSS睡眠/疲劳项目评分、NMSS心境/认知项目评分、NMSS注意力/记忆力项目评分、NMSS胃肠道项目评分中药试验组较对照组显著改善(P<0.05)。MDS-UPDRS II&III部分评分、改良H&Y分期、NMSS泌尿系症状项目评分未见显著差异。(2)网络药理学发现,升阳益胃冲剂中槲皮素、山柰酚、木犀草素、异鼠李素、刺芒柄花素等多种化合物可能通过多靶点、多通路协同作用发挥治疗帕金森病的作用;从交集靶点结果中,黄芪在所有升阳益胃冲剂组成药物中所占交集靶点的比例最高(近75%),覆盖了升阳益胃冲剂最多的交集靶点,且包含大多数升阳益胃冲剂PPI网络中的核心靶点。升阳益胃冲剂及其君药黄芪治疗帕金森病的具体机制可能涉及ERK信号通路、PI3K-AKT信号通路、AGE-RAGE信号通路等,作用靶点可能涉及BAX,Bcl-2,casp-3、IL-6、ERK等蛋白。(3)通过筛选,我们发现黄芪在一定浓度范围内能够显著增强细胞活力(P<0.05),Western blot结果示黄芪提取物组BAX,p-ERK1/2,c-casp-3表达较模型组减少,Bcl-2表达较模型组增加,且与模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。结论:(1)升阳益胃冲剂能够在常规抗帕金森病药物的基础上显著改善患者的某些特定非运动症状(疲劳、抑郁、焦虑、便秘等),改善患者的非运动症状体验。(2)升阳益胃冲剂可能通过多靶点、多通路协同作用发挥治疗帕金森病的作用,网络药理学提示,黄芪作为君药在升阳益胃冲剂中可能居重要地位。(3)升阳益胃冲剂中君药黄芪的水提取物能够显著保护PC-12帕金森病体外模型细胞,增强细胞活力;并可能通过影响ERK1/2的磷酸化水平,及BAX、Bcl-2、casp-3等凋亡相关蛋白的表达,促进帕金森病体外细胞模型细胞的存活。
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