【摘 要】
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目前,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）给人和动物健康带来了巨大威胁,已无特效药物对其引发的疾病进行治疗,亟需加快新型抗MRSA药物的研发。近年来,处于极端环境下的土壤次级代谢产物被认为是新药研发的重要来源,而长白山地区因具有极端气候特征,其土壤次级代谢产物具有极大的研究价值。本研究对长白山部分海拔地区土壤中
【基金项目】
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国家重点研发专项计划（2016YFD0501301）； 吉林省科技厅主题引导项目（20180101003JC）； 吉林省自然科学基金（20190201294JC）；
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目前,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）给人和动物健康带来了巨大威胁,已无特效药物对其引发的疾病进行治疗,亟需加快新型抗MRSA药物的研发。近年来,处于极端环境下的土壤次级代谢产物被认为是新药研发的重要来源,而长白山地区因具有极端气候特征,其土壤次级代谢产物具有极大的研究价值。本研究对长白山部分海拔地区土壤中产次级代谢产物的菌群进行分析,从中分离出一株Bacillus velezensis CB6,其代谢产物对MRSA具有较强抗菌活性,该抗菌代谢产物经纯化鉴定后为31.405kDa的抗菌蛋白CB6-C,进一步对其生物学特性及作用机理展开研究,主要内容如下:1.产次级代谢产物菌群在长白山部分地区土壤分布特征以长白山部分地区采集的270份土壤样品为研究对象,提取其基因组（eDNA）,通过MiSeq PE300平台对16S rRNA V3-V4高变区,PKS KS结构域以及NRPS AD结构域的基因片段进行测序并构建文库。结果显示1100-1600 m以及>1800 m海拔地区土壤次级代谢产物丰度较高,其可能主要来源于芽孢杆菌、链霉菌以及未鉴定细菌等。2.抗MRSA菌株的筛选及其全基因组测序分析以MRSA为指示菌,对土壤中产次级代谢产物丰富的芽孢杆菌、链霉菌及未鉴定细菌进行分离鉴定,筛选得到84株对MRSA具有拮抗作用的菌,经过氧化氢复筛,最终筛选到一株对MRSA具有较强拮抗作用的B.velezensis CB6。进一步对其进行全基因组测序分析,结果显示CB6基因组全长为3963507 bp,含有12个次级代谢产物基因簇,占整个基因组的20.947%。3.抗菌蛋白CB6-C分离鉴定及理化特性研究采用硫酸铵沉降、超滤管超滤、Sephadex G-75凝胶层析柱以及QAE-sephadex A-25离子交换柱等方法逐步对CB6发酵上清液中抑菌活性物质进行分离纯化,经SDS-PAGE、LC-MS/MS鉴定,获得纯度较高的抗菌蛋白CB6-C。该蛋白对革兰阳性菌具有较好抗菌活性,且具有良好的pH稳定性、有机试剂稳定性以及动物安全性。此外,金属离子Co2+、K+以及Ni+可以提高CB6-C的抗菌活性。4.抗菌蛋白CB6-C作用机理的初步研究通过对CB6-C的杀菌动力学试验和与抗生素联合试验,结果表明CB6-C对MRSA具有较好抑制作用,且与氨苄西林具有协同作用。通过质壁分离试验和竞争性抑制试验等对CB6-C作用机理进行初步研究,结果表明CB6-C作用靶点为MRSA细胞壁上的脂磷壁酸。此外,小鼠模型试验显示CB6-C对感染MRSA的小鼠具有治疗效果。
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