目的　　砷是自然界中普遍存在的较丰量的元素之一。环境中常见的砷化物可分为无机砷化物和有机砷化物两大类。无机砷化物主要包括三价的亚砷酸盐和三氧化二砷（俗称砒霜，arsenictrioxide，As2O3）以及五价的五氧化二砷(arsenicpentoxide，As2O5)、砷酸和砷酸盐类。而五价的二甲基胂酸(dimethylarsinicacid，DMA(Ⅴ))则是有机砷化物在环境中的主要存在形式。　　众所周知，砷剂具有强烈的毒性，并呈现致癌或致畸效应。研究普遍认为，无机砷的毒性较大，而有机砷相对毒性较低。而近年来一些研究表明，无机砷甲基化代谢中间产物甲基亚胂酸(monomethylarsonousacid，MMA(Ⅲ)）和二甲基亚胂酸(dimethylarsonousacid，DMA(Ⅲ))的毒性要远远超过无机三价砷。还有一些研究则一致证实了DMA(Ⅴ)的细胞毒性、遗传毒性以及致癌作用。　　另一方面，不同无机和有机砷化物对人和动物具有不同的药用价值。很早人们就使用无机砷化物来治疗牛皮癣、慢性支气管哮喘、慢性皮肤病、寄生虫病和贫血等。目前临床上使用As2O3能够有效地治疗急性早幼粒细胞白血病。而多种人工合成的有机砷化合物可用于治疗梅毒和抗寄生虫病。还有证据表明，适量的砷剂可刺激生血，并促进细胞的生长和繁殖。2010年底，美国航空航天局(NASA)在Science杂志上公布其科研成果并提出砷可能是六大基本生命元素之外的第七种元素的假说。尽管目前对于砷是否是人类必需元素尚不能完全定论，但不同无机和有机砷化物可能具有的这些重要生理功能和潜在的生物学效应正日益在全球科学界引起极大的兴趣。　　核因子Nrf2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2)通路是人类目前发现的哺乳动物体内一套复杂的内源性应答机制，主要用来对抗外源性刺激和氧化损伤。生理状态下，Nrf2与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch-likeECH-associatedprotein1)紧密结合并使其活性处于相对抑制状态。氧化应激刺激下，Nrf2和Keap1解偶联后转移入核，与抗氧化反应元件(antioxidantresponseelement，ARE)结合，启动Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的转录，提高细胞的抗氧化应激能力。　　另一方面，Bach1(BTBandCNChomology1)是存在于细胞核中的一种转录抑制因子。研究已明确，Bach1能与Nrf2竞争性结合ARE，从而下调抗氧化酶的基因表达。因此，在Bach1的抑制作用消除后，即可实现氧化物促进基因的诱导。也有研究提出，Bach1的细胞核输入/输出对于Nrf2活化及其下游靶分子的表达很可能具有重要的调控作用。　　目前的研究已经明确，亚砷酸钠(sodiumarsenite，NaAsO2)是体内多种组织和细胞中Nrf2通路的强烈诱导剂。而其他无机和有机砷化物，是否与NaAsO2具有相似的Nrf2通路活化的作用;不同无机和有机砷化物对Nrf2下游不同的靶分子的调控作用是否存在差异，尚缺乏实验证据。不同无机和有机砷化物能否影响Nrf2的胞核抑制因子Bach1的核转位，从而间接地调控Nrf2蛋白及其下游靶分子的表达诱导，也有待阐明。基于此，本研究以无机砷暴露诱发核因子Nrf2通路活化为出发点，结合不同无机和有机砷化物在化学性质、毒性和作用特点，以及生物学效应等方面存在的明显差异，试图观察和探索不同无机和有机砷化物暴露对细胞内Nrf2通路和该通路的抑制因子Bach1的影响，及其可能存在的调控差异。此外，本研究还初步探讨了Bach1在无机和有机砷化物诱导Nrf2通路活化中的重要调控作用。　　实验方法　　一、细胞培养和砷处理　　Chang肝细胞常规培养于RPMI1640培养液中（含10％FBS，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素），37℃，5％的二氧化碳培养箱中。　　细胞染毒:分别用不同浓度的NaAsO2(10、25和50μM)、As2O3(10、20和30μM)、Na2HAsO4(0.5、1和2mM)以及C2H7AsO2(1、2.5和5mM)分别处理Chang肝细胞(0.5h、1h、2h、4h、6h、12h和24h)。　　二、MTT法检测细胞活力　　染毒结束后，每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，继续培养4h。终止培养，小心吸弃孔内上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)振荡使结晶物充分溶解。用酶标仪在490nm处测定各孔的光密度(OD)值。细胞活力用MTT的还原率表示。　　三、WesternBlot免疫印迹检测蛋白表达　　细胞总蛋白和细胞胞核胞浆蛋白组分的分离和WesternBlot用于检测Nrf2，Bach1,HO-1,NQO1,GR,GSTO1/2,γ-GCSc,γ-GCSm,LaminB和β-actin蛋白表达水平　　四、抗氧化反应元件报告基因活性检测　　Chang肝细胞转导含ARE报告基因的病毒颗粒后，应用1.2μg/ml嘌呤霉素的选择培养基筛选细胞为稳定细胞系。荧光素酶的活性测定采用荧光素酶报告基因检测系统，按照试剂盒说明书操作。荧光素酶活性用细胞活力校正。细胞活力用MTT方法分析检测。　　五、免疫荧光检测　　4％多聚甲醛固定10min，0.2％Triton(Ⅹ)-100通透15min。滴加Bach1Ⅰ抗，4℃湿盒内过夜。次日，PBS洗3次，荧光素酶标记的Ⅱ抗37℃湿盒避光孵育60min。5μg/mlDAPI孵育10min。封片，避光，荧光显微镜下观察。　　六、实时定量RT-PCR分析基因表达　　应用TRIzol法提取总RNA，经PrimeScript反转录酶和OligodT，Random6mers，dNTP转录为cDNA。荧光染料SYBRGreenPCR试剂盒被用于实时定量PCR分析。实时荧光检测使用ABIPRISM7500SequenceDetector(AppliedBiosystems)检测　　七、统计学分析　　数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析，统计结果表示为mean±SD，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异，p＜0.05具有统计学意义。　　实验结果　　一、不同无机和有机砷化物对Chang肝细胞Nrf2蛋白表达的影响　　不同浓度的NaAsO2(10、25和50μM)、As2O3(10、20和30μM)、Na2HAsO4（0.5、1和2mM）以及C2H7AsO2(1、2.5和5mM)分别处理Chang肝细胞6h。Nrf2蛋白表达显著增加，并呈现剂量依赖关系。　　二、不同无机和有机砷化物对Chang肝细胞Nrf2转录活性的影响　　已经稳定表达ARE-荧光素酶基因的Chang肝细胞暴露于NaAsO2(10、25和50μM)、As2O3(10、20和30μM)以及Na2HAsO4(0.5、1和2mM)6h后，荧光素酶活性呈剂量依赖性的增加，且不同浓度的无机砷处理组与对照组比较有显著性差异。而C2H7AsO2(1、2.5和5mM)作用于Chang肝细胞6h后，随着浓度的增加，ARE-荧光素酶活性并未增高，且与对照相比，反而有下降的趋势。　　三、不同无机和有机砷化物对Nrf2调控的下游靶分子蛋白表达的影响　　我们发现三种无机砷暴露后，Ⅱ相解毒酶（HO-1和NQO1）以及谷胱甘肽相关蛋白（GR、GSTO1/2、γ-GCSc/m）表达均显著高于对照组，且表达水平随时间延长逐渐增加。Chang肝细胞暴露1mMC2H7AsO2后，随着暴露时间的延长，与谷胱甘肽合成和代谢相关蛋白表达有所增加;但在6-24h整个暴露时间内，Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO1蛋白一直处于对照水平，并无诱导表达。　　四、多种无机和有机砷化物对Nrf2和Bach1蛋白核质分布的影响　　Chang肝细胞暴露于不同浓度的NaAsO2、As2O3、Na2HAsO40.5、1、2和4h，Nrf2蛋白在核中迅速蓄积，显著增加;相反，随着暴露时间的延长，Bach1的全细胞蛋白提取物逐渐蓄积;细胞核中的Bach1蛋白逐渐缺失，浆中Bach1蛋白表达增多。与三种无机砷相似的是，C2H7AsO2也能够引起核中Nrf2蛋白表达的增加，但C2H7AsO2除了在胞浆中可见少量的Bach1蛋白外，全细胞和胞核中Bach1的蛋白没有明显的表达和变化。　　五、Bach1在无机和有机砷化物诱导Nrf2通路活化中的调控作用　　1、不同砷化物及Nrf2和Bach1调节剂对Chang肝细胞Nrf2和Bach1蛋白核质分布的影响　　MG132处理Chang肝细胞4h引起Nrf2蛋白在全细胞中广泛积累，而且增多的Nrf2蛋白主要转移进入细胞核。MG132也引起Bach1蛋白在全细胞积累，但是Bach1蛋白的核质分布未发生改变，没有明显的Bach1核输出现象。Hemin可以引起Chang肝细胞Nrf2总蛋白增加，而且增多的Nrf2蛋白主要转移进入核中。然而Bach1总蛋白未见在全细胞中积累，但是Bach1在核中明显减少，提示Bach1从胞核易位进入胞质，并在胞浆中进一步降解。而三种无机砷NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4产生Nrf2和Bach1全蛋白蓄积，Nrf2核转位以及Bach1核流出的联合效应，与Hemin和MG132联合作用产生的现象相似。C2H7AsO2处理虽然观察到Nrf2蛋白在全细胞中积累，且增加的Nrf2蛋白大部分入核。但是Bach1总蛋白以及Bach1的核质分布均未见明显变化，既没有明显的Bach1核输出。　　2、不同砷化物及Nrf2和Bach1调节剂对Chang肝细胞Nrf2和Bach1的mRNA表达的影响　　MG132不仅可以抑制Nrf2的蛋白降解，而且还能促进其自身mRNA的新合成，同时Bach1的mRNA水平也有所增加。三种无机砷化物(NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4)都能诱导Nrf2和Bach1自身mRNA的增加;而Hemin处理后，Nrf2和Bach1的mRNA表达水平并无增加。同样我们也观察到有机砷化物C2H7AsO2也不能诱导Nrf2和Bach1的自身mRNA合成增加。　　3、不同砷化物及Nrf2和Bach1调节剂对Chang肝细胞Nrf2转录活性的影响　　除C2H7AsO2外，三种无机砷化物(NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4)以及MG132和Hemin均能诱导Nrf2转录活性增强。　　4、不同砷化物及Nrf2和Bach1调节剂对Chang肝细胞Nrf2通路下游靶分子的mRNA表达的影响　　三种无机砷(NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4)都能显著诱导Nrf2调控的下游靶分子HO-1、NQO1、GR、GSTO1/2和γ-GCSc/m基因的mRNA水平表达增加;其中对HO-1基因的mRNA诱导能力最强。Hemin单独作用以及MG132与Hemin的联合作用都能诱导下游基因的转录表达。MG132单独作用不能诱导HO-1的mRNA表达，但可诱导其他靶分子(NQO1、GR、GSTO1/2和γ-GCSc/m)的mRNA水平表达增加。而C2H7AsO2暴露后，所有检测的下游基因的mRNA水平均未见增加。　　5、不同砷化物及Nrf2和Bach1调节剂对Chang肝细胞Nrf2通路下游靶分子蛋白表达的影响　　三种无机砷化物（NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4）都能够显著诱导Nrf2调控的下游靶分子蛋白的表达。而MG132和C2H7AsO2不能诱导Nrf2调控的下游基因HO-1的蛋白表达。Hemin单独作用以及Hemin和MG132联合作用组，都可明显诱导下游蛋白（HO-1、NQO1、GR、GSTO1/2和γ-GCSc/m）表达。　　结论　　1、NaAsO2、As2O3、Na2HAsO4和C2H7AsO2都能诱导Chang肝细胞核转录因子Nrf2蛋白表达增强。　　2、NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4三种无机砷能够增强Nrf2的转录活性，C2H7AsO2对Nrf2的转录活性没有影响。　　3、NaAsO2、As2O3、Na2HAsO4和C2H7AsO2都能诱导与GSH合成和代谢相关酶（GR、GST和γ-GCSc/m）的蛋白表达。　　4、NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4三种无机砷能够诱导Nrf2调控的Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO1的表达，而C2H7AsO2对HO-1和NQO1蛋白表达无影响。　　5、NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4诱导Chang肝细胞Nrf2蛋白的胞核蓄积，同时调节Bach1从胞核释放至胞质，进而诱导Nrf2转录活性增强，以及下游靶分子的基因转录和蛋白表达。　　6、C2H7AsO2虽然能够诱导Chang肝细胞Nrf2蛋白的胞核蓄积，但不能影响Bach1的核输出机制，因而不能诱导Nrf2转录活性以及下游靶分子的基因转录。　　7、Bach1核输出对于各种无机和有机砷化物诱导的Nrf2通路活化具有重要的调控作用。