家蚕丝腺高表达基因BmeIF5A、BmCyPA的克隆与分析

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利用生物基因组进化中的保守性,具有某一功能的基因在不同物种之间常具有一定的同源性,有目的的克隆基因家族新成员,已经成为新基因克隆的有效策略。同时,结合基因表达序列标签进行基因表达分析,对于发现组织特异表达基因具有重要指导作用。家蚕丝腺是合成和分泌丝蛋白的主要器官,是所有生物中最具活力的蛋白质合成系统的代表,也是理想的生物模型。本论文研究分为三个方面:第一、二两方面利用同源策略和家蚕EST数据,分别从家蚕丝腺克隆得到新的家蚕真核生物翻译启始因子BmeIF5A和亲环蛋白基因BmCyPA,并进行了功能和结构的初步研究;第三方面在全基因组水平对家蚕亲环蛋白基因家族进行了结构和功能分析。 家蚕BmeIF5A基因具有3个外显子2个内含子,推导开放阅读框由160个氨基酸组成,编码分子量为17.5kD,等电点为5.16的蛋白。该基因编码的蛋白质具有保守的hypusine修饰区域,与其他物种来源的42个eIF5A基因进行系统发生分析,结果表明eIF5A基因在系统发生树中同一物种聚在一起,物种之间分群,家蚕BmeIF5A基因表现出高度的序列保守性,在进化上与亲缘关系接近的几种昆虫分为一枝。3RACE研究发现另一具有不同3UTR的基因BmeIF5A-2,与BmeIF5A具有相同的编码区序列,表明家蚕eIF5A基因具有两种剪接形式。家蚕7组织中的表达谱分析显示,BmeIF5A基因以丝腺表达丰度最高,与EST数据一致。分析表明BmeIF5A的高表达丰度可能与丝蛋白起始合成有关,并且可能影响丝腺细胞存活。 家蚕BmCyPA基因由2个外显子1个内含子组成,推导开放阅读框编码由165个氨基酸组成,编码分子量为19.4kD,等电点为8.79的蛋白。3RACE研究得到近全长的序列。序列分析表明家蚕BmCyPA基因具有高度的保守性,具有与CsA侧链结合的氨基酸及肽酰脯氨酸顺反异构酶活性位点,表明可能具有肽酰脯氨酸顺反异构酶活性和与CsA结合特性。CyP基因在系统发生上首先按照基因定位分为两群,各群里同一物种聚在一起,在进化上家蚕BmCyPA与昆虫分为一小枝。家蚕7组织中的表达谱分析显示,BmCyPA在丝腺高丰度表达,与EST数据一致。分析提示BmCyPA基因在丝腺高丰度表达可能对丝蛋白在折叠的启始过程中形成有活性的空间结构非常必要,进而影响丝蛋白分泌效率。 家蚕亲环蛋白(CyP)基因家族在全基因组水平由18条相似序列组成。我们从中克隆得到了新的重要基因BmCyPB,7组织表达谱分析显示在中肠、脂肪体两组织特异表达。CyP基因系统发生分析显示CyP家族基因按照基因定位分为两个群,家蚕BmCyPA、BmCyPB分别位于两个群。家蚕CyP基因家族与人CyPA在氨基酸序列上具有较高的同源性。结构域分析显示家蚕CyP基因家族可分为SD和MD两类,无根进化树将18个家族基因分为两枝。我们根据功能元件相似性预测了SD和MD基因的功能,同样预测了线粒体cyclophilin基因的功能。还通过序列氨基酸位点的置换、缺失和插入分析推测位于胞质cyclophilin基因的功能差异,这些功能差异使蛋白质在三维结构上发生或小或大的变化导致与底物结合的特异性。
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