论文部分内容阅读
对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是对虾最主要的病原体之一，可在短时间内造成对虾大规模的死亡。自上世纪九十年代初在台湾北部发现以来，WSSV已经扩散至世界各地，对全球对虾养殖业造成了严重的经济损失。由于缺乏连续培养WSSV的细胞株及其基因组DNA体外克隆操作系统，WSSV病毒学特性的研究进展缓慢。本研究尝试着通过构建WSSV的细菌人工染色体基因组DNA (WSSV::BAC)，建立病毒基因组DNA体外克隆系统，为研究病毒基因的功能，特别是在病毒经口侵染对虾过程中发挥关键作用的蛋白功能提供一个思路。WSSV::BAC的构建基于含有mini-F因子的转座子。通过体外转座反应插入到WSSV基因组DNA后，使得病毒基因组DNA可以在大肠杆菌中以单拷贝的形式复制。同时，转座子还携带有氯霉素抗性基因。经含有氯霉素的选择性培养基初步筛选之后，再通过WSSV特异性PCR扩增和菌落原位杂交相结合的方法进一步筛选，以期获得含有WSSV::BAC的阳性克隆。为了解决因病毒基因组过大可能会导致克隆成功率过低的问题，本文①采用了电转化的方式，②以可接收外源大片段DNA的电转化感受态E. coli DH10B为受体细胞，③增加了转座反应体系中WSSV基因组DNA和转座子的摩尔数，④降低了转座反应体系中离子浓度，⑤延长了电击时间。结果表明，转座成功率得到提高，并获得了较多的阳性克隆子。研究中以WSSV vp26基因为靶标设计了WSSV特异性的引物和探针。通过菌落PCR和菌落原位杂交技术，筛选含有WSSV::BAC的阳性克隆子。菌落PCR结果表明，在筛选的1452个克隆中，部分克隆传代前可以获得阳性信号，传代后却检测不到阳性信号，同时也提取不到WSSV::BAC。菌落原位杂交结果初步表明，在已筛选的400个克隆中，尚未找到稳定的阳性克隆。本文的研究虽未获得可稳定遗传的WSSV::BAC，但通过后续深入的分析和进一步的研究，有望构建出对虾白斑综合征病毒的细菌人工染色体基因组，为WSSV基因组DNA的体外扩增和修饰，为研究病毒相关基因和蛋白的功能奠定理论基础。