RNA干扰,是最近发现的一种广泛存在于生命体中,高度保守的内源性转录后基因沉默现象。长度为21-25nt的双链小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)以碱基互补配对方式,利用内源性RNA干扰机制,高效、特异地降解靶标RNA (mRNA),从而消除该靶标RNA的功能,例如其调控作用或其对应蛋白的合成。人体内源性RNA干扰途径的发现,极大激发了核酸生物制药技术的研究热度。与传统小分子药物及抗体药物相比,siRNA借助广谱的RNA干扰机制(更加广谱的靶标)和快速的一维药物设计(针对靶标碱基互补的一级序列),具有预防和治疗众多疾病的潜力,这些性质毫无疑问使得RNAi药物技术成为较为理想的生物制药技术。如此理想的药物技术,在成药性方面仍然面临着挑战：siRNA血清稳定性差,细胞膜通透性差,时有脱靶以及免疫副反应。提高RNA干扰效率(超高效性、选择性),将有利于降低给药性难度以及副反应。我们假设：RNA二级结构将会影响RNA血清稳定性以及RNA干扰效率；同时,就像传统的小分子制药技术一样,应该可以利用外源性小分子增效RNA干扰过程。深入理解RNA结构中影响RNA干扰效率的因素,毫无疑问,将加速RNA干扰技术的成药进程。本文围绕如何提高RNA干扰效率(超高效性、选择性),系统研究了RNA二级结构对RNA干扰效率的构效关系。我们通过化学修饰siRNA,改变其拓扑结构,提高了双链siRNA引导链的干扰活性及链间选择性,与此同时,通过化学修饰提高了RNA血清稳定性；从而能进一步提高siRNA有效浓度。我们发现,确实可以找到小分子化合物增效RNA干扰过程,这一研究也促使我们在分子水平上理解特定蛋白因子在RNA干扰通路中的功能。本文具体发现阐述如下：一、高活性以及高特异性小发夹结构RNA (small hairpin-shaped RNA, shRNA)的设计合成与活性测试。天然pre-microRNA或者病毒RNA中经常出现的stem-loop结构,促使我们思考：为什么这些RNA总是含有确定的loop结构,这些loop结构的具体结构细节对于这些天然RNA功能的有效实现是否具有指导意义?含有loop结构的shRNA已经发现具备有效的RNA干扰功能,但具体会体现到RNA干扰效率的哪几个方面上?我们深入研究发现：1、与具有完全相同茎干区域的双链siRNA相比,带有3’-末端悬垂结构的一类shRNA表现出3’-臂链RNA干扰活性显著增强,同时互补链RNA干扰活性极大降低,链选择差异性可达到1000倍；这是首次发现loop结构的适当存在,能够极大改善RNA干扰中双链的脱靶效应。这也为经常发现的天然RNA的功能特异性提供了进一步思考的结构基础。2、改变shRNA5’末端和3’末端的特征结构(包括平末端、5’悬垂结构和3’悬垂结构)以及loop的大小,发现3’末端的悬垂结构与loop结构一道能够增强3’-臂链的RNA干扰活性；这些结果表明RNA干扰效率所包含的高效性及选择性,并不是单一因素就可以完全调控的。如何找到这些结构因素的多因子优化配置将会极大影响RNA干扰效率,进一步表明深入研究RNA二级结构对RNA干扰效率的构效关系是极为必要的。3、通过改变茎干区域碱基序列以及loop的大小和碱基组成,我们发现对于带有3’-末端悬垂结构的shRNA序列,其3’-臂链RNA干扰活性与shRNA的热力学稳定性质密切相关,即与loop的大小密切相关。这些结构因素的优化使得我们首次得到了超高效RNA干扰效果(IC50达到8pM),我们也发现这些结构优化,可以同时降低随从链干扰活性,使得siRNA双链各自的链选择性达到1000倍,实现了siRNA成药性的高活性和高靶标特异性要求。这一类shRNA的超高效活性和超高效链选择性的发现,暗示大家已经接受的RNA干扰机制并不是完全清楚的过程。这些结果为我们进一步深入理解RNA干扰过程提供了新的启示。本工作中所发现的纯天然RNA修饰而建立的RNA二级结构与RNA干扰过程的构效关系,促使我们思考,能否通过更加利于生物制药的化学修饰,来同时实现siRNA成药性的高活性和高靶标特异性(超高效链选择性)。二、高活性以及高稳定性化学修饰siRNA的设计合成与性质表征。通过具有良好生物相容性的巯基-迈克尔加成反应,我们使用小分子linker将末端巯基修饰的siRNA正义链和反义链进行交联,构建不同类型的单端交联发夹结构RNA和双端交联哑铃结构RNA。发现：1、单端交联的发夹结构RNA和双端交联的哑铃型结构RNA均表现出了比双链对照序列显著增强的血清稳定性。双端交联的哑铃型结构RNA在50%正常人血清中的半衰期在48小时以上。这些工作表明,简单的人工loop结构就能够提升RNA的血清稳定性。2、单、双端交联修饰的RNA序列能够被RNA干扰途径中的关键核酶Dicer选择性识别并切割,释放小干扰RNA,实现其RINA干扰效应。表明简单的人工loop结构并不会极大干扰RNA干扰过程。当然,如何实现对RNA干扰过程的精调,从而实现Dicer调控的RNA干扰过程的缓释控制,仍然需要进一步的优化工作。3、我们将构成交联修饰序列的siRNA中反义链定义为A链,其互补链为B链。LhpRNA(B链5’接A链3’-loop结构,具有B链3’悬垂结构)显示出B链RNA干扰活性显著优于RhpRNA序列(A链5’接B链3’-loop结构,具有A链3’悬垂结构)；相反的,RhpRNA中A链RNA干扰活性显著优于LhpRNA.同时,右端交联序列RhpRNA表现出了极高的反义链RNA干扰活性,其对于靶标mRNA沉默的IC50值6pM,为迄今所报道的最高效RNA干扰结果。三、小分子依诺沙星增效RNA干扰过程的分子机制研究。我们实验室发现,小分子抗生素依诺沙星具有对于RNA干扰活性的增强效应。考虑到抗生素依诺沙星通过形成与DNA双链复合物从而抑制DNA解旋酶(DNA gyrase)的杀菌机理,我们提出假设：依诺沙星可能是通过与RNA解旋酶相互作用从而起到RNA干扰增效作用。文献报道RHA (RNA解旋酶A)影响RISC复合物的上载,这些工作促使我们联想依诺沙星与RHA在RNA干扰途径中的协同作用的可能性及其相互作用模式。通过在RHA正常表达、过量表达以及沉默的HEK293细胞中,对依诺沙星与RHA对于RNA干扰的调控现象的观察,我们发现：1、依诺沙星对于siRNA双链的任一链均具有RNA干扰增强作用；2、在RHA特异性沉默的HEK293细胞中,依诺沙星的增强效应降低或者消失。显示依诺沙星对于RNA干扰活性的增强效应具有RHA蛋白表达依赖性。四、使用新型H2S荧光探针探索细胞内源性H2S的产生和抑制过程。内源性H2S生物学最近开始引起研究者关注,其具体机制仍然不甚清楚。考虑到H2S的强生物还原性,我们认为它不仅可能在信号转导过程中有重要作用,也可能在维持体内氧化还原平衡中起到重要作用。文献中认为内源性H2S的手性氨基酸起源仍然需要有效的机制验证和发现。我们发展了基于FRET效应的比例型H2S荧光探针SR400,该荧光探针能满足在活细胞中高灵敏度、高特异性、原位实时定量地对于H2S进行检测。使用SR400探索HEK293细胞中内源性H2S的产生和抑制过程。我们发现：1、D-半胱氨酸能够比L-半胱氨酸更加有效地诱导内源性H2S产生；2、D/L-PPG分子能够同时抑制D-半胱氨酸和L-半胱氨酸对于细胞内源性H2S的诱导产生过程；3、手性差异性抑制剂D-PPG对于D-半胱氨酸诱导过程的抑制强于对于L-半胱氨酸的诱导过程；相反,L-PPG对于L-半胱氨酸诱导过程的抑制强于对于D-半胱氨酸的诱导过程。这种手性依赖的细胞内源性H2S的产生和抑制过程提示我们,D-半胱氨酸和L-半胱氨酸对于细胞内源性H2S的诱导产生过程可能基于两条完全相异的途径。这些工作将有助于通过利用我们发展的超高效及选择性siRNA,对H2S产生和抑制(平衡)机制,进行具体的酶促途径的分类研究,从而理解内源性H2S生物学奠定基础。综上所述,本博士论文围绕如何提高RNA干扰效率(超高效性、选择性),系统研究了RNA二级结构对RNA干扰效率的构效关系。我们通过化学修饰siRNA,改变其拓扑结构(loop结构),显著提高了双链siRNA引导链的干扰活性及链间选择性,以及RNA血清稳定性。我们由此获得迄今最高效的siRNA设计(IC50值<10pM,链选择性可达1000倍)。我们发现,依诺沙星以及RHA(RNA解旋酶A)分别对于siRNA双链的任一链均具有RNA干扰增强作用。与此同时,依诺沙星对于RNA干扰活性的增强效应具有RHA蛋白表达依赖性。我们发展了基于FRET效应的比例型H2S荧光探针SR400,该荧光探针能满足在活细胞中高灵敏度、高特异性、原位实时定量地对于H2S进行检测,我们发现内源性H2S的产生依赖于半胱氨酸的手性,并且其产生过程的抑制也是手性敏感的。