硫及其化合物在生物地球化学循环和生物个体的正常生理活动中都扮演了重要角色。硫在自然界存在多种化合价,从-2～+6价。-2价的硫化氢一直以来被认为是继NO和CO之后的第三类信号分子,在细胞的信号传递及氧化还原稳态的维持等方面发挥了重要作用。过量的硫化氢同样具有毒性,如它可以抑制细胞色素c氧化酶活性从而破坏呼吸链。因此,硫化氢的代谢对于生物体至关重要。多硫化物正是硫化氢的氧化代谢产物的一种,它是地球化学以及微生物过程中的一类重要硫化物,参与了有机物的硫化,黄铁矿的还原以及金属螯合等诸多重要的环境过程。同时,多硫化物也是细胞内部的重要硫化物组分。随着研究的深入,发现其参与了包括信号传递,维持氧化还原状态,代谢调节,生物合成以及细胞内的抗氧化等许多重要的胞内生理过程,并且越来越多的证据表明胞内实际发挥信号分子作用的是多硫化物一类的硫烷硫。因此,不管是在环境中还是细胞内,多硫化物的稳态维持至关重要。我们实验室已经解析了环境异养菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134中一条完整的硫化氢氧化途径,主要由硫醌氧化还原酶SQR(sulfide:quinone oxidoreductase)、过硫化物双加氧酶 PDO(persulfide dioxygenase)和硫转移酶(rhodanese)共同完成将硫化氢氧化成硫代硫酸盐或亚硫酸盐。SQR和PDO在很多菌中同时存在,协同发挥作用。但目前研究表明,有些菌仅单独存在sqr或pdo基因,它们仅能在胞内完成部分硫氧化过程,即将硫化氢氧化成多硫化物(SQR)或者将多硫化物氧化成亚硫酸盐(PDO)。关于多硫化物在细胞内外以及细胞之间的传递一直是未知的。我们发现,很多细菌的pdo基因所在的操纵子上会伴随着2～3个yedE基因共同转录,其编码与硫化物转运相关的膜蛋白。生物信息学分析表明,YedE与诸多硫代谢相关的蛋白存在结构与功能上的关系。同时,yedE基因上游普遍会有家族转录调控因子出现。因此我们推测,yedE及其上游的调控蛋白基因所编码的蛋白可能协同PDO共同发挥了维持胞内多硫化物稳态的功能。在C.pinatubonensis JMP1 34 中,YedE1、YedE2 和 YedE3 是三个较小的膜蛋白,均含有跨膜结构域。我们通过异源表达三个蛋白以及相关硫化物的生理生化实验表明YedE1E2共同作用通过促进多硫化物向胞内转运加速了多硫化物的利用,但是对于多硫化物的外排无明显作用。YedE3对于多硫化物转运无明显作用。序列分析表明,YedE1和YedE2均含有保守Cys。对保守Cys位点突变及一系列生理生化实验揭示了其均参与了 YedE转运多硫化物的功能。系统进化分析表明,yedE1和yedE2基因主要存在于变形菌门中。本文对C.pinatubonensis JMP1 34的yedE1E2上游的可能的转录调控因子基因yedR进行了敲除,荧光定量PCR结果表明,敲除后下游的yedE1E2基因的转录水平出现了明显的上升。我们体外纯化了 YedR蛋白,EMSA结果表明其可以特异性地结合到基因上游启动子附近的区域。由此我们确定了 YedR蛋白作为下游yedE1E2基因的转录抑制因子,调控了下游基因的转录水平。此外,5’RACE实验确定了所在操纵子的转录起始位点。通过构建启动子荧光报告体统,我们进一步验证了 YedR蛋白对于下游基因的转录调控作用。同时通过不同硫化物诱导报告系统证明YedR蛋白能够特异性地感应硫烷硫,并且具有浓度依赖性。体外EMSA实验也表明硫烷硫可以很好地解除YedR蛋白与目的DNA序列的特异性结合,再一次证实了以上结果。YedR蛋白存在四个Cys位点,其中两个保守Cys位点被证实参与了 YedR蛋白感应硫烷硫的过程,另外两个Cys功能尚不清楚。同源建模结果表明,YedR蛋白感应硫烷硫从而解除抑制的机制可能与其蛋白氧化还原状态改变导致的构象变化有关。本文通过一系列实验,揭示了 YedE1E2蛋白作为可能的多硫化物转运蛋白功能,确定了其上游的YedR蛋白能够感应硫烷硫调控下游基因的转录水平,初步提出了 YedE 1E2蛋白、YedR蛋白可能与PDO蛋白协同完成维持胞内多硫化物稳态的机制,为探究异养微生物中的硫代谢途径指明了方向。