第一部分PICK1基因敲除对ASICs通道功能和表达的影响目的:酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)是ENaC/DEG (epithelial Na+ channel/degenerin)通道超家族的成员之一,能被细胞外pH下降或H+浓度上升激活。目前已克隆出的ASICs主要有ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。其中,ASIC1a和ASIC2a是大脑内最重要的两个亚单位,在生理和病理过程中发挥重要作用。PICK1 (protein that interacts with C kinase 1)是ASICs的锚定蛋白,ASIC1和ASIC2与PICK1在背根神经节神经元的外周感觉神经末梢上有共表达,同样也在某些中枢神经元的突触和胞体内有共表达,PICK1还通过其PDZ区域特异性的与ASICs蛋白的C-末端作用。但到目前为止,还没有直接证据证明PICK1对ASICs表达和功能的影响。方法:应用PICK1基因敲除小鼠,采用全细胞膜片钳和钙影像技术,RT-PCR、western blotting和细胞免疫荧光方法,观察PICK1基因敲除对原代培养的皮质神经元ASICs功能的影响,以及皮质上ASICs基因和蛋白表达的影响。结果:PICK1基因敲除后,ASICs功能发生明显改变,而通道的表达不变。1. PICK1基因敲除对ASICs通道功能的影响。⑴原代培养的皮质神经元ASICs电流的特点。形成全细胞模式后,在电压钳模式下,保持电位-80 mV,采用多管灌流系统,将细胞旁外液的pH值由7.4迅速转换成6.0,可诱发出一短暂、快速激活的内向电流,该电流随电压的减少,幅值不断减少;100μM的阿米洛利几乎完全阻断此内向电流。⑵PICK1基因敲除后ASICs电流幅值减小。培养同窝的PICK1基因敲除C57/BL6小鼠皮质神经元并记录ASICs电流,野生型ASICs电流的幅值为224.2±17.59 pA (n=15),杂合子为140.3±28.55 pA (n=17, p<0.05 vs WT),纯合子为61.3±9.62 pA (n=14, p<0.01 vs WT, p<0.05 vs HT)。⑶原代培养的皮质神经元ASICs通道对钙具有通透性。当细胞外液由标准脑脊液迅速转换成pH 6.0的酸性外液后可见细胞内[Ca2+]水平的上升,并随酸性溶液的灌注继续增加,直至达峰值,而后逐渐下降,恢复基线。100μM的阿米洛利可部分阻断酸所诱发的细胞内[Ca2+]水平的上升,500μM则可完全阻断,从而证实该效应为ASICs诱导。⑷PICK1基因敲除后酸诱导的胞内钙增加减少。取同窝培养的PICK1基因敲除C57/BL6小鼠皮层神经元,记录ASICs诱导的胞内钙增加情况,野生型△[Ca2+] / [Ca2+]比值为0.708±0.070 (n=20),杂合子为0.333±0.023 (n=27, p<0.01 vs WT),纯合子为0.195±0.020 (n=26, p<0.01 vs WT, p<0.01 vs HT)。2. PICK1基因敲除对ASICs通道表达的影响。⑴PICK1基因敲除后,ASIC1和ASIC2a的mRNA和蛋白表达均不变。野生型C57/BL6小鼠皮质表达丰富的ASIC1和ASIC2a基因,PICK1基因敲除小鼠的皮质也表达ASIC1和ASIC2a基因,与野生型相比,其含量无明显变化(n=3);同样,野生型与纯合子相比,ASIC1和ASIC2a的蛋白表达也无明显差异(n=6)。⑵PICK1基因敲除后,ASIC1和ASIC2a在细胞膜上的分布减少。免疫荧光的统计结果显示,尽管总的荧光密度无明显改变,但PICK1基因敲除小鼠的皮质神经元,细胞膜上ASIC1和ASIC2a的表达没有野生型完整和连续,荧光强度减弱。结论:1. PICK1基因敲除后,培养的小鼠皮质神经元ASIC电流幅度减少,酸诱导的胞内钙增加也减少。因为在pH 6.0的实验条件下,主要是激活ASIC1a同聚体电流,而且在中枢神经元中,只有ASIC1a同聚体被激活后才对Ca2+通透,推测PICK1基因增加ASICs的功能主要是通过ASIC1a来实现的,ASIC2a也部分参与其中。2. PICK1影响ASICs功能的机制并不在于PICK1敲除后ASIC1或ASIC2a的基因和蛋白表达水平减少,而可能是PICK1的缺失导致ASICs发生定位的改变,其蛋白从膜上转运到胞浆内所致,即ASICs的下膜作用。第二部分PICK1基因敲除对蛋白激酶C调节ASICs功能的影响目的:ASICs的调控受很多因素的影响,包括细胞外和细胞内因素。蛋白激酶PKC是常见的调节ASICs功能的上游因子之一,ASICs上有PKC的磷酸化位点。而PICK1又以其特定的PDZ区域与ASIC1a、ASIC2a和ASIC2b的C末端结合,故上述作用很多都与PICK1有关。既然在上文中我们已经证实,PICK1对ASICs功能的发挥起到重要作用,其基因的缺失会影响ASICs电流以及钙的通透性,那么,其进一步的机制是否与蛋白激酶C有关?PKC、PICK1和ASICs之间是一个怎样的关系和相互作用?这些都值得我们去进一步探讨。方法:采用全细胞膜片钳、钙影像技术,western blotting和细胞免疫荧光技术,观察PICK1基因敲除前后,PKC激动剂和抑制剂对ASICs功能如何影响,探讨可能的机制。结果:1. PKC对小鼠皮质神经元ASICs电流有正性调节作用,该作用依赖于PICK1基因。在给予PKC激动剂或抑制剂前,ASICs电流的幅值在野生型小鼠神经元为228.60±20.09pA (n=13),纯合子为65.40±6.96pA (n=10)。当分别给予10μM GF109203X(PKC抑制剂)和1μM PMA(PKC激动剂)预孵育30 min后,野生型小鼠的电流幅值分别下降为107.50±15.75 pA (n=19, p<0.01 vs control),和增加为756.9±144.9 pA (n=11, p<0.01 vs control)。而在纯合子小鼠组,与对照组相比,无论是PKC抑制剂还是PKC激动剂对ASICs的影响均不明显,其电流值分别维持在64.4±4.81 pA (n=7, p>0.05 vs control )和84.3±13.05 pA (n=10, p>0.05 vs control)。2. PKC对小鼠皮质神经元ASICs介导的钙升高有正性调节作用,该作用也依赖于PICK1的介导。细胞外酸性环境(pH=6.0)诱导出的瞬时钙升高,野生型对照组△F/F为0.662±0.062 (n=17),而纯合子为0.228±0.016 (n=33)。分别给予10μM GF109203X和1μM PMA预孵育后,野生型小鼠钙升高发生了明显改变,即GF109203X使△F/F下降至0.175±0.014 (n=26, p<0.01 vs control),PMA则使△F/F升高到1.08±0.112 (n=14, p<0.01 vs control)。而纯合子小鼠组与对照组相比,无论是PKC抑制剂还是PKC激动剂对△F/F的影响均不明显,其值分别维持在0.218±0.024 (n=20, p>0.05 vs control)和0.267±0.025 (n=13, p>0.05 vs control)。3. PICK1基因敲除后,PKC的蛋白表达和分布不变。Western blotting和免疫荧光的结果均显示,小鼠皮质上无论是总PKC还是特异性与PICK1作用的PKCα的蛋白表达量都未发生改变;PKCα在细胞膜上和胞浆内均匀分布。结论:1. PKC对皮质神经元ASICs电流和ASICs介导的胞内钙增加的正性调节作用依赖于PICK1基因的存在,PICK1在其中起到了桥梁作用。2. PICK1基因敲除后小鼠皮质上PKC和PKCα的蛋白表达总量和分布不变。进一步说明,PKC是通过PICK1的作用调节ASICs通道,PICK1敲除后,这一连接消失,而导致其调节ASICs的功能减弱。第三部分PICK1基因敲除对蛋白激酶A调节ASICs功能的影响目的:蛋白激酶PKA是除PKC外的另一常见的调节ASICs功能的上游因子,ASICs上也有PKA的磷酸化位点,能被其磷酸化,并与PICK1有关。PICK1基因的缺失会影响ASICs电流以及钙的释放,那么,其进一步的机制是否与蛋白激酶A也有关?PKA、PICK1和ASICs之间是一个怎样的关系和相互作用?这些也值得我们去进一步探讨。方法:采用全细胞膜片钳、钙影像技术,western blotting和细胞免疫荧光技术,观察PICK1基因敲除前后,PKA激动剂和抑制剂对ASICs功能如何影响,探讨可能的机制。结果:1. PKA对小鼠皮质神经元ASICs电流及ASICs介导的胞内钙增加有负性调节作用。在给予PKA激动剂或抑制剂前,野生型ASICs电流幅值约为224.2±17.59 pA (n = 15),10μM forskolin(PKA激动剂)与神经元共同孵育30 min后,使电流幅值减小为108±14.67 pA (n=9, P<0.001 vs control),5μM PKA inhibitor fragment 6-22 amide(PKA抑制剂,PKAI)则增加ASICs电流,其值为306.3±22.9 pA (n=12, P<0.01 vs control)。酸诱导的钙升高结果,对照组△F/F值为0.708±0.07 (n=20),10μM forskolin使其减少为0.140±0.013 (n=17,p<0.001 vs control),而5μM PKAI使其增加为0.978±0.108 (n=19,p<0.05 vs control)。2. PICK1基因敲除后,PKA对小鼠皮质神经元ASICs功能的负性调节作用减弱。用培养的PICK1-/-小鼠皮质神经元,观察forskolin和PKAI对ASICs电流的影响。对照组的电流幅值为61.2±9.62 pA (n=14),当分别与10μM forskolin和5μM PKAI共同孵育30 min后,仅forskolin使电流值减少约40%,为36.15±10.15pA (n=10, p<0.05 vs control),用PKAI后电流值仍然维持在和60.82±11.43 pA (n=11, p>0.05 vs control)。酸诱导皮质神经元钙内流增加的改变结果也与ASICs电流的变化一致,对照组△F/F值为0.195±0.02 (n=26),forskolin使其值降为0.157±0.011 (n=20,p<0.05 vs control),PKAI与神经元共同孵育30 min后,其值仍维持在0.170±0.0218 (n=28,p>0.05 vs control)。3. PICK1基因敲除后,皮质上PKA蛋白表达总量未发生改变。4. PKA对ASICs表达无明显影响,在加入forskolin和PKAI孵育24小时后,神经元总的荧光密度不变(p>0.05 vs control)。结论:1. PKA对培养的皮质神经元ASICs功能(ASIC电流和ASICs诱导的钙升高)产生负性调节作用;而PICK1基因敲除后,这种调节作用减弱。即PKA对ASICs功能的负性调节仍然依赖PICK1的作用,但并非全部,可能存在PKA的直接作用或其它影响因素。2. PICK1基因敲除后小鼠皮质上PKA的蛋白表达总量不变,故并非PKA的数量影响了ASIC1和ASIC2a的功能。3. PKA激动剂和抑制剂对野生型小鼠皮质神经元ASICs的表达无影响,故PKA的直接作用并未体现在对ASICs通道数量的改变,可能有其它因素。总结:1. PICK1基因敲除后,小鼠皮质神经元ASICs的功能减弱,其机制可能是ASICs定位发生改变,导致其在细胞膜上的分布减少所致。2. PKC对皮质神经元ASICs的功能有正性调节作用,该作用的发挥依赖于PICK1基因。基因敲除后,正性调节的消失与PICK1的缺失有关,而不是PKC蛋白总量的改变。3. PKA对皮质神经元ASICs的功能有负性调节作用,该作用的发挥部分依赖于PICK1基因的存在,可能还有自身直接作用或其它影响因素存在。基因敲除后,PKA蛋白表达总量不变,但PICK1作用的消失使PKA的负性调节作用受抑制。