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糖尿病是一组由多种病因引起的以长期高血糖为特征的慢性代谢性疾病。随着人们生活水平提高和人口老龄化加剧,糖尿病患病率也逐年增加。据估计到2030年全球将有近5.5亿糖尿病患者。我国最新的流行病学调查数据则显示糖尿病患病率高达11.2%,其中2型糖尿病占90.0%以上。2型糖尿病的主要临床特征之一是胰岛素抵抗,长期糖脂及蛋白质代谢紊乱可引起机体多系统损害,不仅导致眼、肾脏、神经、心脏、血管等多个组织器官慢性进行性病变,还对骨代谢有不同程度影响。早在1948年Albright就报道糖尿病患者长期血糖控制不佳会导致骨质疏松发生。骨质疏松是一种以骨量减少,骨组织微结构破坏,骨脆性增加而易于发生骨折的全身性代谢性骨病。尽管2型糖尿病患者骨密度可表现减低、正常或增加,但是其骨质疏松和骨折发生风险均是增加的。据估计20%-60%的2型糖尿病患者会发生骨质疏松。研究表明与健康对照人群相比,2型糖尿病患者骨折发生风险增加约69%。除此之外,2型糖尿病还会影响骨质疏松治疗效果。目前认为骨脆性增加是2型糖尿病在骨骼系统引起的慢性并发症之一。2型糖尿病可能通过多种途径导致骨量减少,骨组织微结构破坏,骨脆性增加,进而引起骨质疏松或骨质疏松性骨折,但目前具体机制尚不完全清楚。近年来研究发现降糖药物对骨骼有一定的影响。二甲双胍属于双胍类降糖药物,应用于临床已有60多年历史。作为2型糖尿病治疗的一线降糖药物,二甲双胍是目前全球应用最为广泛的降糖药物之一,具有明确的降糖疗效,单独使用或联合用药均可有效降低2型糖尿病患者空腹血糖和餐后血糖。其主要药理作用是通过抑制肝脏糖异生,减少肝糖输出;改善肌糖原合成,降低游离脂肪酸,改善胰岛素抵抗,提高外周组织对胰岛素的敏感性,增加对葡萄糖的摄取和利用;抑制肠壁细胞对葡萄糖的吸收等降低血糖。二甲双胍除了可以降低血糖以外,还可以改善血脂,增加纤溶活性,抑制血小板聚集,改善血管内皮细胞功能等。近年来有关二甲双胍降糖以外作用的研究越来越多。目前有关二甲双胍对骨代谢的影响报道不一。有研究认为二甲双胍可改善去卵巢和生酮饮食导致的骨量丢失,降低骨质疏松和骨折发生风险。而部分研究认为二甲双胍对骨代谢无明显影响。体外研究发现二甲双胍促进成骨细胞系MC3T3E1细胞增殖、分化以及矿化,促进骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）和脂肪干细胞（Adipose stem cells,ASCs）向成骨细胞分化,但具体机制尚未完全阐明。本研究通过构建2型糖尿病和2型糖尿病骨质疏松大鼠模型,观察二甲双胍治疗后2型糖尿病和2型糖尿病骨质疏松大鼠骨密度、骨强度以及血清骨代谢指标变化情况。进一步探讨二甲双胍对2型糖尿病和2型糖尿病骨质疏松大鼠BMSCs向成骨细胞分化影响及潜在机制。观察不同剂量二甲双胍对老年男性2型糖尿病患者血清骨代谢指标影响。本研究共分为三部分:第一部分二甲双胍对2型糖尿病骨质疏松大鼠骨密度与生物力学和血清骨代谢指标影响。第二部分二甲双胍对2型糖尿病骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化影响和潜在机制。第三部分不同剂量二甲双胍对老年男性2型糖尿病患者血清骨代谢指标影响。第一部分二甲双胍对2型糖尿病骨质疏松大鼠骨密度与生物力学和血清骨代谢指标影响目的:探讨二甲双胍对2型糖尿病骨质疏松大鼠骨密度与骨强度和血清骨代谢指标影响。方法:1.将60只2.5-3月龄健康雌性Wistar大鼠适应性喂养1周后随机分为常规饲料组（N=20）和高糖高脂饲料组（N=40）,各组大鼠间体重无统计学差异。常规饲料组大鼠给予常规饲料喂养,高糖高脂饲料组大鼠给予高糖高脂饲料喂养,两组大鼠均喂养8周。禁食12小时后高糖高脂饲料组大鼠左下腹腔注射小剂量链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ 0.1mmol/L,柠檬酸钠配制,p H4.2）30mg/kg,常规饲料组大鼠左下腹腔注射等量生理盐水。注射STZ 1周后,高糖高脂饲料组取大鼠尾静脉测空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）≥7.8mmol/L且伴胰岛素抵抗作为T2DM动物模型。2.T2DM动物模型制备成功1周后,常规饲料组大鼠随机分为正常对照组（NC组,N=10）和单纯去卵巢组（NOVX组,N=10）,高糖高脂饲料组大鼠随机分为2型糖尿病对照组（T2DM组,N=10）、2型糖尿病加二甲双胍治疗组（T2DM+M组,N=10）、2型糖尿病去卵巢组（DOVX组,N=10）和2型糖尿病去卵巢加二甲双胍治疗组（DOVX+M组,N=10）。其中NOVX组、DOVX组和DOVX+M组大鼠均行去卵巢手术。DM组和DM+M组大鼠均行假手术。3.去卵巢后4周DM+M组和DOVX+M组大鼠给予二甲双胍100mg/kg/d灌胃8周,测定各组大鼠体重、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（Fasting insulin,FINS）、血清骨特异性碱性磷酸（Bone alkaline phosphatase,B-ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（Tartrate-resistant acid phosphatase 5b,TRAP-5b）、腰椎骨密度（Bone mineral density,BMD）和腰3椎体最大压缩力（L3-Load）。根据FBG和FINS,计算HOMA-IR指数。结果:1.二甲双胍治疗8周后,与NC组大鼠相比,DM组大鼠体重、FBG、FINS、HOMA-IR指数升高,血清B-ALP降低,血清TRAP-5b升高,BMD和L3-Load下降,均有统计学差异（P<0.05）,NOVX组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR指数、血清TRAP-5b和B-ALP均升高,BMD和L3-Load下降,均有统计学差异（P<0.05）。与DM组大鼠相比,NOVX组大鼠血清B-ALP和TRAP-5b均升高,均有统计学差异（P<0.05）,但二者之间BMD和L3-Load无统计学差异（P>0.05）。与NOVX组大鼠相比,DOVX组大鼠血清B-ALP水平降低,血清TRAP-5b水平升高,BMD和L3-Load下降,均有统计学差异（P<0.05）。与DM组大鼠相比,DM+M组大鼠体重、FBG、FINS、HOMA-IR指数下降,血清B-ALP升高,血清TRAP-5b下降,BMD和L3-Load升高,均有统计学差异（P<0.05）。与DOVX组相比,DOVX+M组大鼠体重、FBG、FINS、HOMA-IR指数下降,血清B-ALP升高,血清TRAP-5b下降,BMD及L3-Load升高,均有统计学差异（P<0.05）。2.进一步Pearson相关分析显示血清B-ALP与体重、FBG、FINS、HOMA-IR指数呈负相关,与BMD呈正相关,均有统计学差异（P<0.05）,与L3-Load无相关性,无统计学差异（P>0.05）。血清TRAP-5b与体重、FBG、FINS、HOMA-IR指数呈正相关,与BMD和L3-Load呈负相关,均有统计学差异（P<0.05）。小结:1.2型糖尿病和2型糖尿病骨质疏松大鼠骨形成减少,骨吸收增加。2.二甲双胍可能通过体重、血糖、胰岛素抵抗改善2型糖尿病和2型糖尿病骨质疏松大鼠骨密度与骨强度和血清骨代谢指标。第二部分二甲双胍对2型糖尿病骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化影响及潜在机制目的:探讨应用二甲双胍治疗8周后2型糖尿病骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化影响及潜在机制。方法:1.采用本课题第一部分NC组、DM组、DM+M组、NOVX组、DOVX组、DOVX+M组大鼠,分别取各组大鼠双侧股骨采用全骨髓贴壁法获得BMSCs单细胞悬液传代至第3代进行成骨细胞诱导分化培养至第7天进行碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色,测定ALP活性,提取细胞总RNA和蛋白,分别通过Real-time RT-PCR和Western blot测定Runx2 RNA水平和蛋白水平表达情况。2.培养至第14天进行茜素红（Alizarin red,AR）染色测定钙沉积,提取细胞总RNA和蛋白,分别通过Real-time RT-PCR和Western blot技术测定OCN RNA水平和蛋白水平表达情况。3.于成骨细胞诱导分化培养至第3天通过Western blot技术测定p AKT和AKT表达情况。结果:1.ALP活性测定结果显示,与NC组相比,DM、DM+M、NOVX、DOVX和DOVX+M组成骨细胞ALP活性下降,均有统计学差异（P<0.05）。与NOVX组相比,DOVX组成骨细胞ALP活性下降,有统计学差异（P<0.05）。与DM组相比,DM+M组成骨细胞ALP活性增加;与DOVX组相比,DOVX+M组成骨细胞ALP活性增加,均有统计学差异（P<0.05）。2.Real-time RT-PCR结果显示,与NC组相比,DM、DM+M、NOVX、DOVX和DOVX+M组成骨细胞Runx2和OCN m RNA水平表达减少,均有统计学差异（P<0.05）。与NOVX组相比,DOVX组成骨细胞Runx2和OCN m RNA水平表达减少,有统计学差异（P<0.05）。与DM组相比,DM+M组成骨细胞Runx2和OCN m RNA水平表达增加;与DOVX组相比,DOVX+M组成骨细胞Runx2和OCN m RNA水平表达增加,均有统计学差异（P<0.05）。3.Western blot进一步印证上述结果。与NC组相比,DM、DM+M、NOVX、DOVX和DOVX+M组成骨细胞Runx2和OCN蛋白水平表达减少,均有统计学差异（P<0.05）。与NOVX组相比,DOVX组成骨细胞Runx2和OCN蛋白水平表达减少,有统计学差异（P<0.05）。与DM组相比,DM+M组成骨细胞Runx2和OCN蛋白水平表达增加;与DOVX组相比,DOVX+M组成骨细胞Runx2和OCN蛋白水平表达增加,均有统计学差异（P<0.05）。4.茜素红（AR）半定量结果显示,与NC组相比,DM、DM+M、NOVX、DOVX和DOVX+M组成骨细胞钙沉积减少,均有统计学差异（P<0.05）。与NOVX组相比,DOVX组钙沉积减少,有统计学差异（P<0.05）。与DM组相比,DM+M组钙沉积增加;与DOVX组相比,DOVX+M组钙沉积增加,均有统计学差异（P<0.05）。5.各组大鼠成骨细胞诱导分化培养至第3天时通过Western blot技术测定p AKT和AKT表达情况。结果显示,与NC组相比,DM、DM+M、NOVX、DOVX和DOVX+M组成骨细胞p AKT/AKT比值下降,均有统计学差异（P<0.05）。与NOVX组相比,DOVX组成骨细胞p AKT/AKT比值下降,有统计学差异（P<0.05）。与DM组相比,DM+M组成骨细胞p AKT/AKT比值增加;与DOVX组相比,DOVX+M组成骨细胞p AKT/AKT比值增加,均有统计学差异（P<0.05）。小结:1.2型糖尿病和2型糖尿病骨质疏松大鼠BMSCs向成骨细胞分化减少,碱性磷酸酶活性降低,钙质沉积减少。2.二甲双胍可能通过AKT磷酸化促进2型糖尿病和2型糖尿病骨质疏松大鼠BMSCs向成骨细胞分化,增强碱性磷酸酶活性,增加钙质沉积。第三部分不同剂量二甲双胍对老年男性2型糖尿病患者血清骨代谢指标影响目的:探讨不同剂量二甲双胍对老年男性2型糖尿病患者血清骨代谢指标影响。方法:1.选取2018年7月至2019年6月于沧州市中心医院内分泌二科门诊就诊的120例老年男性2型糖尿病患者。随机分为试验组（N=60）和对照组（N=60）。2.试验组患者口服大剂量二甲双胍0.5g 4次/日,对照组患者口服小剂量二甲双胍0.5g 2次/日,各组均服药12周。两组患者均于治疗前后测定血清Ⅰ型前胶原N末端肽（Type I collagen N-terminal peptide,PINP）、骨钙素N端中分子片段（N-terminal midfragment,N-MID）、Ⅰ型胶原C末端肽β特殊序列（β-isomerized C-terminal telopeptides,β-CTX）和25-羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D,25[OH]D）水平等。结果:1.治疗后试验组和对照组降糖效果无统计学差异（P>0.05）。2.治疗前试验组和对照组之间血清骨代谢指标均无统计学差异（P>0.05）。治疗后两组血清骨代谢指标均改善。试验组血清25（OH）D水平均高于对照组,有统计学差异（P<0.05）。试验组血清N-MID和β-CTX水平均低于对照组,有统计学差异（P<0.05）。两组间血清PINP水平无统计学差异（P>0.05）。小结:1.大小剂量二甲双胍均能有效控制老年男性2型糖尿病患者血糖。2.大小剂量二甲双胍均有助于改善老年男性糖尿病患者血清骨代谢指标,且呈剂量依赖性。