论文部分内容阅读
溶藻菌主要是指通过直接或间接作用方式抑制富营养化水体中的微藻的生长并进一步溶解藻细胞的一类水环境微生物。绝大部分溶藻菌可以利用水体中的微藻类为碳源,氮源等无机能源进行生长,并且参与其代谢和降解过程。大量研究表明,选用微生物方法除藻具有高效、节约资金、二次污染风险低等优势,已成为目前国内外作为治理淡水湖泊水体富营养化的首选方法,所以进一步深入探究溶藻菌特性和抑藻活性物质,以及溶藻过程中的机理具有深远的现实意义。本实验选用在淡水资源中分布广泛、造成危害最大的水华蓝藻代表——铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)为控藻对象,从富营养化的水体中通过液体侵染法筛选出1株具有高效溶藻效果的溶藻菌EHB01。利用16S rRNA基因序列分析法,结合微生物形态学特征和溶藻菌生理生化等试验特征,对菌株EHB01进行鉴定。利用有机溶剂相似相溶的原理,通过有机溶剂对菌株EHB01的发酵粗提液进行萃取,并通过气相-质谱联用仪对萃取的物质进行了GC-MS分析。采用单因素试验和响应面设计方法,进行菌株EHB01溶藻条件的优化。主要得到以下结果:1.在富营养化水样中筛出一株具有高效溶藻效果的细菌,通过形态学染色,扫描电镜观察与16S rRNA基因序列分析法结合,该菌株与Ralstonia pickettii CP12(KF378754.1)之间的序列相似性高达98.33%。判断该菌株属罗尔斯顿菌属(Ralstonia)。2.菌藻共培养72 h,通过测定藻细胞叶绿素含量,可知溶藻率最高可达83.2%,且处于对数期和稳定期的细菌EHB01对溶藻效果最佳,分别为83.2%和78.6%。进一步将细菌EHB01发酵培养后离心分别得到细菌上清液,菌体和发酵液,将其分别与藻共培养60 h,测定藻细胞叶绿素含量。结果表明,各实验组的叶绿素含量与对照组相比均有所下降。菌体组的叶绿素含量为2.86±0.02 mg/L,发酵液组和无菌上清液处理组的叶绿素含量分别为1.34±0.06 mg/L和1.29±0.03 mg/L,说明细菌EHB01的发酵液具有很强的溶藻效果。3.选用有机溶剂氯仿和乙酸乙酯对细菌EHB01的发酵粗提液进行反复萃取,并通过气相质谱联用仪(GC-MS)对萃取的溶藻活性物质进行分析,结果显示:乙酸乙酯提取物的抑藻能力高于氯仿提取物。根据乙酸乙酯和氯仿提取物的GC-MS分析结果,初步判定EHB01发酵物中至少产生14种挥发性化合物,包括9-octadecenoic acid,(E)-octadecenoic acid,glycidyl oleate等。4.采用单因素试验对菌藻共培养过程中的发酵液浓度、温度、光照以及C:N和N:P进行了分析,并对溶藻细菌EHB01发酵液的碳源、氮源和pH进行了优化。基于单因素试验,采用中心组合试验设计(Central composite design,CCD)确定各个关键因子的最佳影响水平,并以Desig-Expert 8.0.5进行回归分析检测,通过响应面分析获得溶藻效果最佳的参数。结果表明:发酵液浓度对溶藻率的影响表现为持续上升;温度对溶藻率表现为先上升后下降;而光照、C:N和N:P均对细菌EHB01发酵液溶藻率的影响表现为先降低后上升的趋势。溶藻细菌EHB01发酵液所需的最佳碳源为蔗糖,氮源则为硝酸钾,pH为7.5,优化条件下溶藻率达86.97%,与优化之前相比提高了21.72%。