蜘蛛是最成功的有毒动物和陆生食肉动物之一,它们巧妙地利用蛛丝和毒液迅速制服猎物。作为蜘蛛捕食的重要武器,毒液由成对的毒腺合成。蜘蛛毒液成分复杂多样,根据化学组分和药理学的研究,可以将其组分分为五大类:大多数蜘蛛毒液中均有的小分子化合物（离子、氨基酸、多胺、有机酸等）、存在于部分蜘蛛毒液中的抗菌肽（又称线性肽、阳离子肽、溶细胞肽）、富含二硫键的神经毒性肽（神经毒素）、非酶类的蛋白质和酶类。蜘蛛多肽类具有多种药理学上的活性,其中富含二硫键的多肽是大多蜘蛛毒液的主要成分,作用于猎物外周神经肌肉接头或中枢神经系统的突触处,靶向突触前离子通道或突触后受体,从而扰乱猎物神经系统功能,麻痹猎物。目前蜘蛛毒素作为杀虫剂资源最为前沿的研究是通过纳米材料的包装,增强蜘蛛毒素在昆虫体内的稳定性,提升杀虫活性和速效性。除了杀虫活性外,蜘蛛毒液中的一些多肽可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖或引起肿瘤细胞的凋亡,因此蜘蛛毒肽作为药理学工具和药物开发的先导受到了广泛的关注。本文以害虫游猎型天敌拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）为研究对象,分析神经毒素的组织分布和序列特征、预测作用靶标,并选取两种富含二硫键的神经毒素,经原核表达、体外制备后,开展杀虫活性和细胞毒性的研究。用两种制备毒素处理三种不同来源和特性的细胞,检测昆虫细胞Sf9的增殖活力、观察肿瘤细胞RKO和A549的形态变化和凋亡相关蛋白表达水平的改变。最后,对Sf9细胞增殖有抑制作用的PPTX-4毒素,采用带相反电荷的纳米材料进行包装,并初步探索Sf9细胞对纳米材料PPTX-4复合体在不同时间点的摄入情况,为纳米毒素的研制提供理论和技术基础。一、拟环纹豹蛛神经毒素分析通过高通量测序技术获得了拟环纹豹蛛9个组织（前足、第二对足、第三对足、后足、触肢、螯肢、脑、毒腺、脂肪体）的转录组信息,并在实验室前期分析的毒腺转录组分析的基础上,对6个家族的31条假定的神经毒素基因在9个组织中的表达进行比较分析,结果表明有22条神经毒素基因在毒腺中高表达,5条基因在脂肪体中高表达,2条基因在脑中高表达。根据组织表达和序列特征分析结果,我们通过定量PCR分析其中5条神经毒素基因在毒腺、脑和脂肪体中的组织表达水平。除PPTX-28在脑中高表达外,其余4条毒素基因在毒腺中都特异高表达。最后我们对在毒腺中特异高表达的PPTX-4和在脑中高表达的PPTX-28进行分析,发现它们具有不同的半胱氨酸排列方式、不同的二硫键个数,并预测它们作用于不同的离子通道。二、两种富含二硫键的多肽毒素的制备及对Sf9、RKO和A549细胞的毒性研究在本实验室前期构建的多肽毒素体外表达系统的基础上,采用原核表达载体pLicC-MBP进行了 PPTX-4和PPTX-28的体外表达和纯化制备。我们将2种神经毒素通过显微注射入褐飞虱体腔,发现PPTX-4可以引起褐飞虱麻痹,其中PD50（half paralytic dose）约为 780.8 pmol/g（2 h）和 2271 pmol/g（12 h）,而 PPTX-28对褐飞虱的麻痹作用比较弱,PD50为19361 pmol/g（2 h）和LD50为22606 pmol/g（24 h）。然后,我们将梯度浓度（0、10、20、40、80、100 μg/mL）的2种毒素处理昆虫细胞Sf9并检测了毒素对该细胞的增殖活力,并观察肿瘤细胞RKO和A549细胞在细胞形态上的变化和检测RKO细胞内凋亡相关蛋白水平的变化。PPTX-4对Sf9细胞具有一定的增殖抑制作用,在毒素浓度为100 μg/mL时可引起超过40%的细胞生长受到抑制。通过对两种肿瘤细胞的形态观察,我们发现PPTX-4对两种肿瘤细胞生长没有显著影响,不具备肿瘤细胞抑制活性。与PPTX-4结果不同,PPTX-28对Sf9细胞的增殖抑制作用不明显,在毒素浓度为100μg/mL时细胞生长抑制率约为20%;其对肿瘤细胞A549无显著影响,但对肿瘤细胞RKO生长有一定的抑制作用,且RKO细胞中p53蛋白水平增加。最后,利用由 PLys（poly-L-lysine）和 PGlu（poly-γ-glutamic acid）多肽形成的纳米材料包裹PPTX-4毒素,获得纳米毒素材料,并对Sf9细胞摄入纳米毒素的效率进行了评估,其毒力有待进一步测试。