【摘 要】
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目的:构建表达CTB-Cap融合蛋白的重组乳酸乳球菌,并对重组乳酸乳球菌的免疫原性进行研究。方法:1.根据NCBI登录的CTB和PCV2 Cap基因序列,设计合成CTB和Cap串联的基因序列(CTB-Cap),将与表达载体p NZ8148连接的CTB-Cap电转化到乳酸乳球菌NZ9000中构建重组乳酸乳球菌,重组乳酸乳球菌经乳酸链球菌素(Nisin)诱导表达后,采用SDS-PAGE和Western
【基金项目】
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山西省重点研发计划项目(国际科技合作方面)(201903D421037); 山西省重点研发计划重点项目(201703D211001); 山西省“1331 工程”重点创新团队建设项目(20171115);
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目的:构建表达CTB-Cap融合蛋白的重组乳酸乳球菌,并对重组乳酸乳球菌的免疫原性进行研究。方法:1.根据NCBI登录的CTB和PCV2 Cap基因序列,设计合成CTB和Cap串联的基因序列(CTB-Cap),将与表达载体p NZ8148连接的CTB-Cap电转化到乳酸乳球菌NZ9000中构建重组乳酸乳球菌,重组乳酸乳球菌经乳酸链球菌素(Nisin)诱导表达后,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达产物,ELISA测定CTB-Cap融合蛋白浓度。2.重组乳酸乳球菌置于模拟胃液、肠液和高渗透压溶液中,于不同时间点进行菌落计数,检测重组菌的耐受性。羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)标记的重组乳酸乳球菌通过口服给予小鼠,流式细胞术检测不同时间点重组菌在肠道内的留存情况。3.重组乳酸乳球菌分别以1010CFU、109CFU、108CFU、107 CFU的不同剂量口服接种小鼠,接种3次,间隔7 d,每次连续接种3 d;ELISA检测血清中抗Cap特异性Ig G水平,粪便和肠道中抗Cap特异性s Ig A水平。4.重组乳酸乳球菌分别以2.5×1010 CFU、5×109 CFU、5×108 CFU的不同剂量皮下注射接种小鼠,接种2次,间隔14 d;ELISA检测血清中抗Cap特异性Ig G水平。结果:1.SDS-PAGE和Western blot结果显示,CTB-Cap融合蛋白在重组乳酸乳球菌中表达,且100 m L培养液可获得50.5 mg融合蛋白。2.耐受性试验结果显示,重组乳酸乳球菌在p H 3.5、3.0、2.5和2.0模拟胃液环境中培养5h的存活率分别为100%、85.7%、1.4%和0;在模拟肠液环境中培养12h存活率为89.4%;在盐浓度1%、3%、5%、7%的溶液中培养5 h存活率分别为99.2%、81.7%、70.2%和64.9%,培养12 h的存活率分别为9.5%、10.5%、5.8%和1.4%。表明重组菌对模拟胃液的耐受性差,对模拟肠液和高渗透压环境具有良好的耐受性。肠道留存情况结果显示,在单次灌胃和连续灌胃的小鼠肠道中均未检测到荧光信号,表明重组菌未在小鼠的肠道中留存。3.口服接种结果显示,与空菌组和PBS组相比,接种重组乳酸乳球菌小鼠的抗Cap特异性Ig G和s Ig A水平没有明显变化(p>0.05),表明重组乳酸乳球菌经口服接种后不能诱导机体产生黏膜和体液免疫反应。4.皮下接种结果显示,与PBS组相比,2.5×1010试验组小鼠的抗Cap特异性Ig G水平明显升高(p<0.05),5×109试验组和5×108试验组没有明显变化(p>0.05),表明重组乳酸乳球菌经皮下接种后,能够诱导机体产生体液免疫反应。结论:构建了可稳定表达CTB-Cap融合蛋白的重组乳酸乳球菌,重组乳酸乳球菌经口服接种后不能诱导机体产生特异性的免疫反应,经皮下接种后可以诱导机体产生特异性的免疫反应。
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