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亚麻荠（Camelina sativa（L.）Crantz）是十字花科植物中一种低投入高产出的油料作物,且具有低需肥量、高抗病虫害能力以及极强环境适应能力等优异农艺性状。亚麻荠种子含油量高达干重的47%,因其脂肪酸组成中富含90%以上不饱和脂肪酸而被广泛应用于航空燃油、生物柴油及高价值油脂产品的生产。且亚麻荠油还富含人体必需脂肪酸—α-亚麻酸,占总含油量的32-40%。随着亚麻荠油市场不断扩大,大量研究集中在通过基因工程和基因组编辑技术提高亚麻荠油产量及质量等农艺性状上。因此,深入了解亚麻荠油脂生物合成分子机制将为亚麻遗传改良和高价值产品的商业化提供理论依据。油料作物种子油脂主要以三酰甘油（Triacylglycerols,TAG）形式积累与储存,二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferases,DGAT）是催化TAG合成（Kennedy途径）最后一步反应的关键限速酶。在真核生物中至少鉴定出三种不同的DGAT,分别为结合于内质网膜的DGAT1和DGAT2,以及无跨膜结构的可溶性酶蛋白DGAT3。编码DGAT3的基因已在诸多油料作物中发现,但其生物学功能还未鉴定。为深入探究亚麻荠油脂合成的分子机制,本研究对亚麻荠CsDGAT3基因家族进行全基因鉴定,克隆各成员的编码序列,检测其时空表达谱,通过TAG缺陷型酵母突变体功能互补试验和烟草遗传转化及其表型分析等,系统鉴定CsDGAT3基因的功能。主要研究结果如下:1.以花生（Arachis hypogaea）AhDGAT3氨基酸序列为索引,Blast亚麻荠基因组获得三个候选同源基因,命名为CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3,分别编码361、364和365个氨基酸组成的蛋白。转录组数据分析显示CsDGAT3基因转录本均含有完整的开放阅读框（ORF）,具有表达活性。生物信息学分析发现,这三个基因编码的蛋白都含有TRX-like Fd家族的典型结构域,均是定位于细胞质、无跨膜结构的水溶性酶蛋白。三级结构模拟揭示这三个蛋白均以含有[2Fe-2S]结构域同源二聚体形式存在。多序列比对分析表明亚麻荠CsDGAT3蛋白均具有DGAT典型的保守域以及酰基转移酶结合位点。系统发育分析显示三个CsDGAT3蛋白与拟南芥AtDGAT3蛋白同源性最高,暗示其具有可能的共同起源。2.RT-PCR和qRT-PCR检测亚麻荠CsDGAT3基因在不同组织中表达谱显示,CsDGAT3基因在所测组织中均有表达,但表达量有差异。CsDGAT3-1主要在根中表达,CsDGAT3-2主要在花和萌发种子中表达,而CsDGAT3-3则在发育中种子中高表达。这表明三个基因可能在不同组织中行使功能。应用高保真RT-PCR从亚麻荠发育种子中分别克隆得到三个CsDGAT3基因的编码序列,大小分别为1092 bp、1095 bp和1098 bp。3.为鉴定亚麻荠CsDGAT3基因的功能,分别在TAG缺陷型酵母H1246中异源表达CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3。转基因酵母细胞尼罗红染色和细胞油脂的TLC分析显示,这三个CsDGAT3基因过表达均能使H1246酵母恢复TAG合成能力,而且CsDGAT3-3过表达酵母细胞的TAG积累量明显高于其他两个基因过表达细胞TAG含量。这表明亚麻荠CsDGAT3蛋白具有DGAT酶活性且CsDGAT3-3的酶活性更强。应用气相色谱（GC）分析转基因酵母细胞油脂成分表明,过表达CsDGAT3-3酵母细胞棕榈油酸（16:1）和油酸（18:1）含量均高于转CsDGAT3-1和CsDGAT3-2基因酵母的含量。进一步通过在酵母培养基中分别添加外源不饱和脂肪酸（亚麻荠种子富含的18:2,18:3和20:1）培养转CsDGAT3-3基因酵母。酵母细胞油脂脂肪酸成分检测显示,与未添加外源不饱和脂肪酸的酵母细胞相比,分别添加外源不饱和脂肪酸的酵母细胞显著富集这些不饱和脂肪酸,特别是20:1积累最多,预示着CsDGAT3-3对不饱和脂肪酸尤其是C20:1有较高的底物特异性。4.为进一步鉴定CsDGAT3基因是否可在其他高等植物体细胞组织内行使功能,采用农杆菌介导的叶盘法将CsDGAT3植物组织特异性表达载体转入普通烟草（Nicotiana tabacum）,通过DNA和RNA检测鉴定出转基因烟草植株。分析转基因烟草叶片总脂与脂肪酸组分发现,分别过表达CsDGAT3基因均可增加烟草叶总脂含量。转CsDGAT3-1的烟叶C18:1和C20:0的含量升高,分别是转空载烟叶的0.75倍和1.53倍。转CsDGAT3-2的烟叶C18:2和C18:3比转空载烟叶分别提高了50.74%和31.24%。然而,表达CsDGAT3-3则显著提高C20:1的脂肪酸积累,比转空载烟叶C20:1含量提高了225.4%,这与在培养基中添加外源C20:1培养的转CsDGAT3-3酵母细胞积累高量C20:1的结果相一致。进一步说明CsDGAT3-3对不饱和脂肪酸尤其是C20:1有底物选择性。CsDGAT3-1和CsDGAT3-2的底物特异性还需进一步研究确定。综上所述,本文从亚麻荠鉴定并克隆到三个编码DGAT3酶蛋白的CsDGAT3基因,且首次通过TAG缺陷型酵母H1246功能互补试验和烟草遗传转化论证了这三个酶蛋白的生物学功能,尤其是阐明了CsDGAT3-3高酶活性及其对C20:1的底物选择性。这些发现为深入理解亚麻荠CsDGAT3基因参与种子油脂生物合成和调控的机制提供了新见解,亦为其他油料作物提高种子油脂产量和富集C20:1等不饱和脂肪酸的基因工程奠定了优异的目的基因元件。