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第一部分流式细胞术检测循环微泡方法及外周血标本处理参数研究目的：探讨离心速度、离心时问、储存条件及抗凝剂对血浆来源微泡(microvesicles, MVs)数量及大小分布的影响。方法：离心获取肝素及EDTA抗凝血无血小板血浆(platelet free plasma, PFP)及MVs, calcein-AM标记MVs后,应用流式细胞仪检测、分析MVs数量及大小分布,研究不同离心条件(速度：16000×g和20500×g；时间：15、30和60分钟)、储存条件(PFP于-80℃储存一周或四周：MVs于4℃储存3-4天或一周：MVs于-80℃储存一周或四周)及抗凝剂(肝素或EDTA)对循环MVs数量及大小分布的影响。结果：经calcein-AM标记后,流式细胞术检测发现EDTA抗凝血浆来源MVs与肝素抗凝血浆来源MVs均为小于1μm粒子,MVs大小主要分布于0.2-0.5μm之间,其次为0.5-0.8μm区间,而在0.8-1.0μm区间分布数量最少;MVs数量不受抗凝剂影响,但抗凝剂影响MVs大小分布；不同离心速度及时间对MVs数量及大小分布无明显影响；肝素抗凝血浆来源MVs或PFP储存不同时间显著改变MVs数量及大小分布；EDTA抗凝血浆来源MVs数量及大小仅在MVs储存于-80℃高达四周后受到影响。结论：Calcein-AM能够有效地从血浆中鉴定出MVs,可作为annexin-V的替代物用于标记MVs行流式检测。与肝素相比,EDTA能够更好地保存MVs数量及大小。PFP于16000×g离心15分钟足以满足提取MVs的需要,这有利于标本的批量处理。与MVs这一储存状态相比,PFP状态是更好的储存方法。该研究提供了MVs收集、储存及分离提取的方法学,为今后MVs作为疾病生物标记物的研究提供了很好的指导。第二部分多发性骨髓瘤患者循环微泡与疾病相关性研究目的：研究多发性骨髓瘤患者循环骨髓瘤细胞来源MVs(multiple myeloma-derived MVs, MM-MVs)及骨髓瘤干细胞来源MVs数量与疾病临床特征及其主要生化指标的相关性,为今后MM-MVs作为多发性骨髓瘤(multiple myeloma. MM)新型生物标记物的确立提供实验依据；初步探讨骨髓瘤患者骨髓及尿液标本中MVs的流式检测。方法：采用第一部分研究中确立的方法收集正常对照及MM患者外周血标本,同时收集MM患者尿液及骨髓标本,差异离心法获取MVs, calcein-AM标记后,流式细胞术分析MVs数量及其表面不同CD分子(CD138, CD38, CD45, CD19)表达特点,统计分析正常对照与MM患者循环MVs数量及表面抗原表达差异,分析评估MM-MVs与MM临床特征的相关性。结果：CD138单个表面标记可以鉴别正常对照及MM患者循环骨髓瘤细胞来源MVs,我们将calcein-AM+、CD138+、直径小于1μm的粒子定义为MM-MVs, MM患者循环MM-MVs数量明显高于正常对照,该结果表明MM-MVs具有诊断价值；MM患者循环MM-MVs数量与骨损害、肾损害呈明显正相关关系,与临床常用的提示肿瘤负荷及预后指标乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、β2微球蛋白(β2-croglobulin, β2-MG)值正相关;MM-MVs数量与临床疾病分期、分型暂无相关性。CD38是除CD138外MM另一常用检测指标,MM患者外周血循环CD138+CD38+MVs数量及其在总MVs中所占比例均明显高于正常对照；MM患者循环CD138+CD38+MVs数量与β2-MG及LDH值有正相关关系,提示可用于检测肿瘤预后。CD138-CD19+或CD38+CD45-是目前公认的MM干细胞表面标记,我们认为表面具有这些标记的MVs为MM干细胞来源。MM干细胞来源MVs数量(CD138-CD19+和CD38+CD45-MV数量之和)及其在总MVs中的比例明显高于正常对照；MM患者干细胞来源MVs数量与β2-MG相关(r=0.461, p=0.047).患者骨髓及尿液标本中也可检出具有上述表面标记的MVs。结论：应用流式细胞术,通过对MVs表面抗原的检测,我们可在MM患者外周血中检测到MM特异性MVs。这些循环MVs与MM常见临床并发症及预后指标明显相关,有望成为新型MM生物标记物用于临床辅助诊断及预后判断,并为今后从MM-MVs这一全新视角研究MM发病机制提供了有力的临床依据。本研究首次检出MM干细胞来源MVs,有力拓展了临床MVs的研究宽度。骨髓及尿液标本中同样可检测到MM特异性MVs,且尿液具有标本获取简单无创的优点,有助于进一步推进MVs在MM中的应用。第三部分多发性骨髓瘤细胞微泡对肾小管上皮细胞作用及机制初探目的：研究人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226、U266细胞来源微泡(MM-MVs)对人肾小管上皮细胞HK-2的作用并初步探讨其机制,以人慢性髓细胞白血病细胞株K-562细胞来源MVs作为疾病对照。方法：RPMI8226. U266及K-562细胞经无血清培养基培养24h后差异离心法获取MVs,随后作用于HK-2细胞。CCK-8法检测不同浓度(1、5、10、50μg/ml)MVs处理不同时间(24、48、72h)后HK-2细胞的生长增殖情况；Annexin V-PI凋亡试剂盒检测不同浓度MVs作用不同时间(24、48、72h)后HK-2细胞的凋亡及坏死情况；Western blotting检测10μg/ml MVs作用48及72h后HK-2细胞内caspase-3(凋亡指标)、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin (上皮间质转化指标)、p-MLKL (坏死性凋亡指标)及LC3(自噬指标)蛋白表达水平变化。结果：CCK-8检测发现不同浓度MM-MVs作用48h后能够明显抑制HK-2细胞的生长,而作用72h后MM-MVs对HK-2细胞的生长抑制作用明显减弱；不同浓度K-562细胞来源MVs作用HK-2细胞不同时间对HK-2细胞生长无明显影响。AnnexinV-PI标记HK-2细胞,流式细胞术检测后发现不同浓度RPMI8226、U266细胞来源MVs作用HK-2细胞48h后细胞有明显凋亡或坏死发生,且随着MV浓度的增加凋亡率明显升高,而作用72h后HK-2细胞呈现明显凋亡抑制;K-562细胞来源MVs对HK-2细胞的凋亡或坏死无明显影响。Western blotting检测发现10μ/ml MVs处理48h后,HK-2细胞内caspase-3、 pMLKL、E-cadherin、N-cadherin及LC3蛋白表达增加,提示细胞发生凋亡、坏死性凋亡及自噬,而vimentin蛋白表达下降；K562-MVs作用48h后,上述蛋白变化不明显。不同细胞来源MVs作用HK-2细胞72h后,细胞内各蛋白变化趋势与48h时基本相同。值得注意的是,与48h相比,MM-MVs处理HK-2细胞72h后,细胞内caspase-3表达水平下降,提示72h时MM-MVs促HK-2细胞凋亡能力下降。结论：MM-MVs作用于HK-2细胞48h后抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、诱导细胞发生凋亡性坏死及自噬,作用72h后HK-2细胞凋亡受抑；而K-562细胞来源MVs对HK-2细胞生长增殖及凋亡无明显影响。这些结果提示,MM-MVs对HK-2细胞的作用具有疾病特异性,可能是MM肾损害的全新机制。