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纤维素酶可分为组成酶和诱导酶,组成酶是纤维素酶产生菌在阻遏培养基中产生的纤维素酶,这些酶一般是低表达的,酶活很低。诱导酶是纤维素酶接种在含有纤维素基质的培养基中产生的,属于诱导型纤维素酶。大多数自然界中纤维素都是不可溶的,而固体不溶性纤维素是怎样进入真菌细胞内从而来诱导纤维素酶基因表达,早在20世纪,研究者就提出真菌可以产生极低水平的基础性纤维素酶,在没有诱导条件下也可以产生,这个基础性纤维素酶的作用是识别胞外纤维素底物,结合底物,并对其进行很低水平的水解,水解后产生的小分子的可溶性产物,可以进入胞内从而来诱导纤维素酶基因的高效表达,这个猜测后来被证实成丝状真菌分解纤维素的一种模型。所以对组成型内切葡聚糖酶的研究具有重大意义。本实验对匍枝根霉组成型内切葡聚糖苷酶基因进行了克隆、表达及酶学性质研究。有助于我们了解组成型内切葡聚糖苷酶的相关性质。实验把匍枝根霉于2%葡萄糖为唯一碳源的组成酶培养基中培养,在发酵液中检测到有内切葡聚糖苷酶酶活,并对产酶条件进行优化,得出最优培养条件为：培养温度30℃,摇床转速为180rpm,装液量为60ml/250ml,添加0.3%碳酸钙。此时匍枝根霉的组成型内切葡聚糖苷酶分泌在30h达到最大为0.92IU。根据匍枝根霉在组成型培养基中有组成型的纤维素酶的分泌,构建了匍枝根霉阻遏型文库,从中筛选出阳性克隆子,zegl大小为1164bp, zeg2大小为1251bp。zegl大小为1164bp,编码387个氨基酸,zegl的分子式为C1814H2858NN556O567S24,相对分子量为42297.4Da,理论等电点为9.42,属于碱性蛋白质,推测半衰期大于10h。亲水性平均系数(GRAVY)为-0.459,结合ProtScale的分析结果,推断zegl为可溶性蛋白。zeg2大小为1251bp共编码416个氨基酸,zeg2的分子式为C1959H3046N594O607S24,相对分子量为45400.7Da,理论等电点为9.44,属于碱性蛋白质推测半衰期大于10h。亲水性平均系数(GRAVY)为-0.505,结合ProtScale的分析结果,推断zeg2为可溶性蛋白。经比对zegl和zeg2有86%的相似性,有相似的催化活性区域。经CDD(保守序列数据库)分析,该蛋白归属于糖苷水解酶第5家族,对比PDB(蛋白结构数据库)中第五家族的关键催化残基,预测该两个蛋白的第147位的谷氨酸(E)及199为的色氨酸(W)为该蛋白的催化残基。重组菌发酵液粗酶进行酶学性质研究,得出zegl和zeg2的最适反应温度为50℃,最适反应pH都是5.0。两种酶在30-50℃时酶的稳定性较好,温度大于60℃很快丢失酶活,zegl比zeg2稳定性好。zegl在pH在4.0-7.0之间酶活相对较稳定,zeg2在pH在5.0-7.0之间酶活相对较稳定。pH的稳定性比较可以看出zegl比zeg2更稳定。研究了金属离子对重组酶活的影响,结果表明Mg2+、Ca2+、Zn2+对zegl内切葡聚糖苷酶有明显促进作用,Ca2+对zeg2内切葡聚糖苷酶有很明显促进作用,Al3+、Mn2+对这两种重组酶的内切葡聚糖苷酶有明显的抑制作用。用CMC-SDS-PAGE电泳较准确的测算出zegl和zeg2蛋白的分子量分别为55KD、58KD。