银杏叶中含有200多种药用成份,其中黄酮类和萜内酯类含量较高。黄酮类化合物主要是由槲皮素、山奈酚和异鼠李素等黄酮苷元以及它们与葡萄糖等单糖以氧糖苷键联接而成的糖苷组成,以糖苷形式存在的黄酮占到提取物黄酮总含量的95%以上。萜内酯化合物又称银杏萜内酯,由倍半萜内酯和二萜内酯组成,主要包括银杏内酯A,B,C,J,M和白果内酯。银杏黄酮具有扩张血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、调血脂等作用,可用于治疗心脑血管疾病、肾病综合征、糖尿病、血管性痴呆等。黄酮类化合物结构中羟基的数量、位置以及是否被甲基化或糖基化对黄酮类化合物的活性有重要影响,黄酮苷元的生物活性明显优于糖苷,黄酮糖苷在动物体内的生物利用度低于苷元型黄酮。由德国科学家提出,现在国内外制药行业所用的标准化银杏叶提取物(EGB 761)以黄酮苷含量≥24%,内酯含量≥6%,为其质量控制标准,标准中没有规定苷元的含量。本课题主要以EGB 761为原料制备含有不同比例黄酮和萜内酯的银杏叶提取物,研究银杏叶总黄酮中苷元与糖苷的抗肿瘤药效学和药动学的差异,以及内酯类成份对黄酮类成份药效和体内过程的影响,进一步明确银杏叶提取物的药效物质基础,为银杏叶的开发和临床应用提供理论依据。第一部分银杏叶提取物中黄酮类成份的提取分离与制备目的:以标准银杏叶提取物为原料制备无内酯银杏叶提取物(EGB 761-DT)、无内酯银杏水解物(EGB 761-DT-H)和银杏叶提取物水解物(EGB 761-H)样品,并分离制备槲皮素、山奈素和异鼠李素苷元单体样品。方法:银杏叶总黄酮与银杏叶总内酯用有机溶剂萃取法进行分离,用酸水解法制备总苷元,再用聚酰胺柱分离得到苷元单体,最后用制备液相制备纯度较高的苷元单体。结果:制备的三个样品均符合实验要求,分离的三个苷元单体槲皮素、山奈素和异鼠李素含量均大于98%。结论:本实验方法简便,制备成本低,可将银杏叶提取物中的内酯与黄酮分离,通过酸水解可制备总苷元样品,经制备液相所得苷元纯度较高,可用于药效学和药动学研究。第二部分银杏叶提取物中黄酮类成份的药动学研究目的:1.建立可同时测定大鼠血浆中槲皮素、山奈素和异鼠李素苷元的检测方法,用于研究大鼠口服和尾静脉注射银杏叶提取物、银杏叶水解物、无内酯银杏叶提取物和无内酯银杏叶水解物后黄酮类主要成份槲皮素、山奈素和异鼠李素药动学的差异,考察槲皮素、山奈素和异鼠李素的生物利用度;2.明确内酯类成份对黄酮类成份药动学的影响。方法:1.大鼠以灌胃和尾静脉注射给予槲皮素、山奈素、异鼠李素,EGB 761、EGB 761-DT、EGB 761-H和EGB 761-DT-H,分别于给药后不同时间眼眶静脉丛取血,置于加入抗坏血酸溶液并肝素化的塑料离心管中,样品预处理采用25%盐酸与甲醇(1:4)组成的溶液沉淀蛋白,利用HPLC法,色谱柱为Alltech brava BDS C18(250×4.6mm, 5μm);流动相:甲醇-0.5%磷酸液(55:45);柱温:30℃;流速:1mL·min-1,检测波长370 nm;2.采用3P97软件计算药代动力学参数。结果:1.槲皮素的线性范围10~2000ng·mL-1,日内与日间RSD < 15%,回收率92.3%~94.9%;山奈素的线性范围10~2000ng·mL-1,日内与日间RSD < 15%,回收率91.8%~94.4%;异鼠李素的线性范围10~2000ng·mL-1,日内与日间RSD < 15%,回收率98.4%~100.1%。2.大鼠单次灌胃或注射给予不同成份的EGB 761提取液、槲皮素、山奈素和异鼠李素后,主要药动学参数分别如下:EGB 761中槲皮素、山奈素和异鼠李素的Cmax分别为0.264±0.056,2.504±0.839和0.714±0.184μg·mL-1,Tmax均为12.00h,MRT分别为16.85±0.83,16.37±0.96和16.45±0.67h,AUC0-t分别为3.956±1.066,33.220±12.386和9.575±2.875μg·h·mL-1;EGB 761-DT中槲皮素、山奈素和异鼠李素的Cmax分别为0.400±0.073,0.991±0.347和0.374±0.150μg·mL-1,Tmax分别为3.20±1.43,7.20±3.25和8.40±1.96h,MRT分别为10.1±0.38,12.16±0.72和13.48±1.85h,AUC0-t分别为4.803±0.561,15.536±5.570和4.727±1.750μg·h·mL-1;EGB 761-H中槲皮素、山奈素和异鼠李素的Cmax分别为2.566±0.431,10.114±1.559和1.799±0.247μg·mL-1,Tmax分别为3.14±0.43,2.29±0.25和2.59±0.22h,MRT分别为9.35±0.32 , 7.12±0.10和10.42±0.21h , AUC0-t分别为28.165±7.414,94.513±30.532和25.491±6.934μg·h·mL-1;EGB 761-DT-H中槲皮素、山奈素和异鼠李素的Cmax分别为3.456±0.287,18.628±1.134和3.753±0.248μg·mL-1,Tmax分别为0.69±0.16,1.09±0.25和0.94±0.22h,MRT分别为7.36±0.18 , 8.14±0.09和8.43±0.14h , AUC0-t分别为24.215±2.866,187.280±27.916和37.043±7.178μg·h·mL-1;槲皮素、山奈素和异鼠李素苷元单体的Cmax分别为1.088±0.337,14.644±4.081和0.180±0.037μg·mL-1,Tmax分别为0.44±0.21,0.54±0.08和2.70±2.05h,MRT分别为9.16±0.15 , 8.25±0.36和9.74±2.01h , AUC0-t分别为8.995±2.216,141.298±28.188和2.087±0.247μg·h·mL-1。灌胃给药后EGB 761和EGB 761-DT中的槲皮素、山奈素和异鼠李素的生物利用度均较低;而EGB 761-H和EGB 761-DT-H样品中的槲皮素、山奈素和异鼠李素的生物利用度均较高。3.大鼠尾静脉注射给予不同成份的EGB 761提取液、槲皮素、山奈素和异鼠李素后,主要药动学参数分别如下:EGB 761中槲皮素、山奈素和异鼠李素的MRT分别为8.39±0.16,8.68±0.32和7.59±0.27h,AUC0-t分别为0.822±0.125,3.441±0.797和0.861±0.292μg·h·mL-1;EGB 761-DT中槲皮素、山奈素和异鼠李素的MRT分别为7.620±0.77 , 8.31±1.57和7.32±0.35h , AUC0-t分别为0.835±0.231 ,5.250±1.083和1.227±0.054μg·h·mL-1;EGB 761-H中槲皮素、山奈素和异鼠李素的MRT分别为4.78±0.27,8.22±0.14和7.78±0.20h,AUC0-t分别为10.657±3.057,110.832±16.869和37.740±3.670μg·h·mL-1;EGB 761-DT-H中槲皮素、山奈素和异鼠李素的MRT分别为4.119±0.14,7.82±0.20和7.57±0.20h,AUC0-t分别为11.834±2.667,112.790±23.520和37.712±5.860μg·h·mL-1;槲皮素、山奈素和异鼠李素苷元单体的MRT分别为6.36±0.18,7.88±0.18和8.91±0.14h,AUC0-t分别为11.073±1.581,127.596±16.734和7.223±0.796μg·h·mL-1。结论:1.采用甲醇盐酸溶液为沉淀剂除蛋白的方法,建立了HPLC同时测定大鼠血浆中槲皮素、山奈素和异鼠李素浓度的方法,对不同成份的EGB 761样品药动学过程进行了研究;2.口服给药后,以苷元为主要成份的水解产物(EGB 761-H和EGB 761-DT-H)中三种成份的达峰时间较短,在体内吸收较快,生物利用度高;3.静脉注射给药后,以糖苷为主要成份的银杏叶提取物(EGB 761和EGB 761-DT)中三种成份在体内转化为黄酮苷元的量较少,相对生物利用度较低;4.样品中槲皮素在体内很快转化为异鼠李素;5.内酯类成份可影响苷元的吸收过程,对黄酮的代谢无明显影响。第三部分银杏叶提取物中黄酮类成份的体外抗肿瘤活性研究目的:研究不同成份的EGB 761样品,EGB 761、EGB 761-DT、EGB 761-H和EGB 761-DT-H体外对不同瘤株的抗肿瘤活性差异,同时与三个苷元样品槲皮素、山奈素、异鼠李素的抗肿瘤活性进行对比,探讨银杏叶总黄酮中苷元与糖苷之间的抗肿瘤活性差异以及萜内酯类对黄酮类抗肿瘤活性的影响。方法:1.选用人胃癌细胞株(SGC-7901)、人肝肿瘤细胞株(HepG2)和小鼠淋巴白血病细胞(L1210),置37℃,5% CO2饱和湿度孵箱内培养,传代后取对数生长期细胞进行实验。2.采用MTT染色法测定样品对三种瘤株的抑瘤作用,用改良Karber公式计算抑制率。结果:1. EGB 761,EGB 761-H,EGB 761-DT和EGB 761-DT-H对SGC-7901瘤株的生长有明显的抑制作用,并且呈剂量、时间依赖关系。EGB 761-H和EGB 761-DT-H对SGC-7901瘤株48h的IC50基本相当;EGB 761和EGB 761-DT对SGC-7901瘤株48h的IC50基本相当,但两个水解物(EGB 761-H和EGB 761-DT-H)的IC50比EGB 761和EGB 761-DT低大约2倍。EGB 761-H和EGB 761-DT-H在高浓度可达到较高的抗瘤活性。药物作用72h后,12.5μM EGB 761和EGB 761-DT抑瘤率仍然较低分别为23%和18%,而相同剂量的EGB 761-H和EGB 761-DT-H的抑瘤率已经达到40%和60%。槲皮素、山奈素和异鼠李素对SGC-7901瘤株48h的IC50值分别为31.56±1.55,43.81±3.54,24.23±0.86。2. EGB 761,EGB 761-H,EGB 761-DT和EGB 761-DT-H对HepG2瘤株的生长有明显的抑制作用,并且呈剂量、时间依赖关系。EGB 761-H和EGB 761-DT-H对HepG2瘤株均有一定的抑制作用,但EGB 761-H与EGB 761-DT-H的IC50相比有统计学差异(P<0.05),而EGB 761和EGB 761-DT对HepG2瘤株48h的IC50基本相当,但两个水解物(EGB 761-H和EGB 761-DT-H)的IC50比EGB 761和EGB 761-DT低大约2倍。EGB 761-H和EGB 761-DT-H在高的浓度可达到较高的抗瘤活性。药物作用72h后,25μM EGB 761和EGB 761-DT抑瘤率仍然较低,分别25%和31%,而相同剂量的EGB 761-H和EGB 761-DT-H的抑瘤率已经达到56%和48%。3. EGB 761,EGB 761-H,EGB 761-DT和EGB 761-DT-H对L1210瘤株的生长有明显的抑制作用,并且呈剂量依赖关系,EGB 761-H和EGB 761-DT-H对L1210瘤株48h的IC50基本相当,但EGB 761-H与EGB 761-DT-H的IC50相比有统计学差异(P<0.05),而EGB 761和EGB 761-DT对L1210瘤株48h的IC50基本相当,两者大约相差4倍。EGB 761-H和EGB 761-DT-H在中浓度即可达到较高的抗瘤活性。结论:1.采用MTT法对不同成份的EGB 761样品对SGC-7901,HepG2和L1210细胞株的的抑制作用进行了研究;2. EGB 761-H和EGB 761-DT-H对三种细胞株的抑制作用均较强,提高EGB 761中苷元的浓度可提高抗肿瘤活性;3.内酯类成份可提高苷元对HepG2和L1210的活性,但对黄酮糖苷的活性无明显影响。第四部分银杏叶总黄酮体外抗肿瘤作用机制研究目的:对EGB 761、EGB 761-H和EGB 761-DT-H的抗肿瘤作用机制进行初步研究,探讨黄酮类苷元与糖苷间抗肿瘤活性机制上的差异。方法:以人胃癌细胞株SGC-7901为细胞模型,采用姬姆萨染色和Hoechst33258染色观察细胞形态学变化,研究不同成份EGB 761对肿瘤细胞的诱导凋亡作用的差异;通过检测端粒酶活性及其亚单位hTERT mRNA表达,探讨不同成份EGB 761的抗肿瘤作用与端粒酶活性的关系。结果:1. EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H样品作用48h均可引起SGC-7901细胞凋亡,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05);与EGB 761(调亡率30%)相比,EGB 761-H和EGB 761-DT-H(调亡率>50%)样品的诱凋亡作用更强(P<0.05),姬姆萨染色和Hoechst33258染色后,镜下均可见大量凋亡细胞出现;2.相同浓度EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H均可降低端粒酶活性,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05);与EGB 761相比,EGB 761-H和EGB 761-DT-H样品对SGC-7901端粒酶活性的抑制作用更强(P<0.05);3.经相同浓度EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H样品作用48h后,SGC-7901细胞hTERTmRNA的表达明显下降,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05);与EGB 761相比,EGB 761-H和EGB 761-DT-H样品对SGC-7901端粒酶活性的抑制作用更强(P<0.05)。结论:不同成份的EGB 761样品可通过诱导细胞凋亡和抑制端粒酶活性发挥其抗肿瘤活性,三个样品具有相似的作用机制,但相同浓度下EGB 761-H和EGB 761-DT-H的作用强于EGB 761样品。第五部分银杏叶总黄酮体内抗肿瘤作用及抗氧化活性研究目的:研究EGB 761、EGB 761-H和EGB 761-DT-H样品体内抗动物移植瘤作用,以及在模型动物体内抗氧化作用的差异。方法:1.采用小鼠移植性荷艾氏腹水癌研究EGB 761、EGB 761-H和EGB 761-DT-H对小鼠生命延长的影响;2.采用小鼠移植性S180肉瘤模型对EGB 761、EGB 761-H和EGB 761-DT-H的体内抗实体瘤作用进行研究,并同时取胸腺和脾脏组织研究三个样品对小鼠免疫功能的影响,取血浆测定三个样品对小鼠氧化还原体系的影响。结果:1.阳性药5-FU对艾氏腹水癌的生命延长率为94.2%(P<0.05),同浓度的EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H对荷瘤小鼠表现出一定的生命延长作用,EGB 761-H和EGB 761-DT-H小鼠的生命延长率达64.5%,但远不及阳性药物,与阳性药物相比较具有显著性差异(P<0.05),而EGB 761的活性最低;2. EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H 10mg·kg-1口服给药对S180肉瘤即有抑瘤作用,与生理盐水组相比,均有显著性差异(P<0.01),与阳性对照组无明显差异。但EGB 761样品的抑瘤率较低,EGB 761-H和EGB 761-DT-H的效果较好,提示在体内EGB 761中苷元的含量可影响其活性,苷元的活性比糖苷的高,而EGB 761-H和EGB 761-DT-H组间药效无差异,提示内酯对黄酮苷元的体内药效无明显影响。EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H对小鼠重要器官重量的均无明显影响,表明所有样品对小鼠免疫系统无影响,体内应用毒性较低。阳性药5-FU在本试验中显示出明显的副作用,脾脏、胸腺严重萎缩,用药过程中动物耐受较差。3. EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H能明显降低荷瘤小鼠血浆MDA含量,增强CAT、SOD和GST的活力。显示EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H具有良好的抗氧化和抑制脂质过氧化反应的活性。结论:1. EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H表现出对荷S180瘤小鼠有抑瘤作用,10mg·kg-1EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H对S180肉瘤的抑瘤率分别是41.7%、63.7%、60.7%。2. EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H表现出对荷艾氏腹水癌瘤小鼠有生命延长作用,10mg·kg-1EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H对荷艾氏腹水癌小鼠生命延长率分别为32.6%、64.51%、52.9%。3. EGB 761,EGB 761-H和EGB 761-DT-H对荷瘤小鼠的免疫系统无影响,具有良好的抗氧化和抑制脂质过氧化反应的活性。4. EGB 761-H和EGB 761-DT-H样品的抗肿瘤活性较强,提示提高EGB 761中黄酮苷元的含量可提高EGB 761的药效,内酯对黄酮类化合物的抗肿瘤活无明显影响。