随着近年来急诊介入治疗或者紧急溶栓治疗普及和实施,大量的急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者不仅挽回了生命,还改善了预后,但缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤始终是AMI再灌注治疗过程中棘手的问题,已有大量研究证实AMI再灌注治疗后存在明确的心肌损伤,常常引起心肌细胞凋亡、左室重构、心衰和心律失常等情况发生,如何降低I/R损伤、减少细胞凋亡坏死成为目前冠心病研究中的一个热点之一。我们研究的重点是干预心肌梗死后的细胞凋亡这个环节,以提高AMI患者的生存率和改善预后。乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)是糖代谢途径中的一个重要酶,参与糖酵解即丙酮酸转化成乳酸的过程;而目前研究发现LDHA能够参与细胞的增生和凋亡,特别是在肺癌、胆管癌等肿瘤疾病中已发现LDHA的过表达可减少细胞凋亡坏死,促进肿瘤细胞的增生,这可能与肿瘤细胞在生长过程中相对能量不足,LDHA表达增强使肿瘤细胞适应能量代谢的一种自我保护机制。既然LDHA参与了细胞的增生和凋亡,因此我们推测,LDHA可能与冠心病AMI后细胞凋亡有一定关系,或许会成为再灌注治疗后干预细胞凋亡的一个靶标。本研究首先分析了AMI患者再灌注治疗后细胞凋亡的现象和相应因素;再通过大鼠心肌梗死I/R模型进一步证实了AMI再灌注后存在明确的细胞凋亡,同时伴有细胞LDHA表达的增多,推测LDHA表达增多可能与I/R损伤的自适应保护有关;最后通过进一步制作原代心肌细胞缺氧复氧模型,深入的研究了LDHA对I/R心肌细胞凋亡作用的影响,为AMI患者I/R损伤的预防和临床治疗提供了理论依据和新的思路。第一部分急性心肌梗死患者PCI后血清凋亡蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2的变化及影响因素的研究目的:研究AMI患者急诊PCI后血清凋亡蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2的变化,并进一步分析相关因素,以阐明心肌梗死患者再灌注治疗后细胞凋亡的影响因素。方法:严格根据标准筛选病例,分为急性心肌梗死组和对照组,所有入选患者均于术后第三天抽取静脉血行酶联免疫法测定血清凋亡蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2,比较两组之间的差异,并根据亚组分析凋亡蛋白的影响因素。同时,我们还比较了两组患者的心肌酶(CK-MB和cTnI)和左心功能(LVESVI、LVEDVI、LVEDD和LVEF)等指标。实验分组:(1)急性心肌梗死组(AMI Group):入选标准为首次诊断AMI患者,出现心肌梗死症状均超过30分钟,且ST段在2个或2个以上相邻导联持续抬高(≥1mm)或新出现的左束支传导阻滞,同时后续心肌酶证实升高的患者。患者53例,男33例,女20例;<60岁21例,60-70岁20例,≥70岁12例,平均年龄(62±10)岁;合并患糖尿病者15例,同时患高血压者20例;发病至球囊扩张时间≤6h 25例,6-12h 28例;单支病变24例,双支病变29例;前壁或前间壁梗死13例,广泛前壁梗死12例,下壁梗死15例,后壁梗死13例。(2)对照组(Control Group)为胸痛患者住院,并行急诊冠脉造影,结果是未见明显狭窄病变,或者存在狭窄病变,但狭窄程度小于50%,血管远端TIMI血流3级者,共计48例,男29例,女19例;平均年龄(60±9)岁,其中合并患糖尿病者12例,同时患高血压者17例。结果:1.两组患者凋亡蛋白caspase-3和Bax含量有明显差异,P<0.05,差异有统计学意义,其中心肌梗死组患者较对照组明显升高;而Bcl-2含量两组间无差异,P>0.05。另外两组患者心肌酶(CK-MB和cTnI)和左心功能(LVESVI、LVEDVI、LVEDD和LVEF)有明显差异,P<0.05,差异有统计学意义,其中心肌梗死组患者心肌酶明显升高,左心功能彩超指标较对照组显著下降。2.心肌梗死组中行亚组分析,结果显示三个凋亡蛋白含量在不同年龄组、不同性别组、是否伴有高血压、是否伴有糖尿病、不同病变支数组之间均无差异,P>0.05;但在不同再灌注时间组中三个凋亡蛋白含量存在明显差异,P<0.05,差异有统计学意义,其中caspase-3和Bax在6-12小时再灌注组明显升高,Bcl-2明显降低。3.亚组分析还提示,不同梗死部位组血清凋亡蛋白含量存在差异,P<0.05,差异有统计学意义;两两比较结果显示,广泛前壁心肌梗死组的三个凋亡蛋白含量均与其它组别有显著差异,P<0.05,其它组两两之间无差异,P>0.05,说明心肌梗死患者血清凋亡蛋白含量在广泛前壁组与其它组有明显差异,其中caspase-3和Bax明显升高,Bcl-2明显降低。结论:1.心肌梗死组患者存在明确的心肌细胞坏死和凋亡,并且伴有心功能的下降。2.不同时间再灌注治疗时,心肌细胞凋亡有差异,再灌注时间越晚,细胞凋亡越明显。3.广泛前壁心肌梗死时,心肌细胞凋亡发生较明显。第二部分大鼠心肌缺血再灌注损伤对LDHA表达和细胞凋亡影响的研究目的:通过制作大鼠心肌I/R损伤模型,研究大鼠心肌I/R损伤对心肌细胞凋亡和LDHA表达的影响。方法:选用雄性Wistar大鼠,通过结扎并松解前降支动脉,制作大鼠急性心肌梗死I/R模型,以观察心肌组织内LDHA的表达和细胞凋亡。分组:(1)假手术组(Control Group):开胸暴露心脏,于主动脉与左心耳之间找到前降支,于距离前降支起点约2-3mm处穿线不结扎。(2)缺血再灌注组(I/R Group):开胸暴露心脏,于主动脉与左心耳之间找到前降支,并采用套管法于同一位置阻断前降支血流30分钟,随后再灌注120分钟。然后通过染色观察心肌缺血坏死面积,通过TUNEL法计算细胞凋亡指数,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)方法检测细胞凋亡相关蛋白(caspase-3、Bax、Bcl-2)和LDHA表达,采用real-time PCR法检测LDHA的mRNA表达水平。结果:1.从梗死面积来看,I/R组心肌缺血面积和梗死面积远大于Control组(P<0.05),存在显著差异,具有统计学意义;另外TUNEL染色提示,与Control组比较,I/R组心肌细胞凋亡指数均明显升高(P<0.05),差异存在统计学意义。2.免疫印迹检查结果提示,与Control组比较,I/R组caspase-3和Bax蛋白的表达水平均明显升高(P<0.05),而I/R组Bcl-2蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),差异均存在统计学意义。由此可见缺血再灌注大鼠心肌细胞中促凋亡蛋白caspase-3和Bax的表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,从而促进细胞凋亡的发生。3.免疫印迹检查还提示,与Control组比较,I/R组LDHA的表达水平均明显升高(P<0.05),差异均存在统计学意义。4.PCR检查结果示,与Control组比较,I/R组LDHA基因表达水平均明显升高(P<0.05),差异存在统计学意义。有此可见,缺血再灌注大鼠中心肌细胞中LDHA mRNA的基因表达水平升高,LDHA产物增加,可能与细胞凋亡存在密切关系。结论:1.心肌I/R损伤可使大鼠的心肌组织存在明显细胞坏死和凋亡。2.心肌I/R损伤使大鼠的心肌组织中凋亡蛋白caspase-3和Bax的表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,从而促进细胞凋亡的发生。3.心肌I/R损伤使大鼠的心肌组织中LDHA和LDHAmRNA表达增加,可能与细胞凋亡存在密切关系。第三部分LDHA靶控PDK1/Akt/mTOR通路对大鼠缺血再灌注心肌细胞的凋亡影响目的:探讨LDHA对心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡的影响,并深入研究LDHA通过PDK1/Akt/mTOR通路对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡作用的分子机制。方法:使用Wistar大鼠乳鼠原代心肌细胞,通过氧糖剥夺再灌注损伤模型模拟心肌I/R损伤,经历缺氧3h,再灌注3h处理。实验分为以下四组:(1)空白对照组+空载体组(Control组):心肌细胞在常氧条件下培养,用Lipo2000脂质转染剂介导pcDNA3.1(+)载体转染细胞;(2)空白对照+LDHA转染组(Control+LDHA转染组):心肌细胞在常氧条件下培养,用Lipo2000脂质转染剂介导pcDNA3.1(+)-LDHA载体转染细胞;(3)模型组+空载体组(H/R组):转染pcDNA3.1(+)原代心肌细胞后,缺氧3h后复氧3h;(4)模型组+LDHA转染(H/R+LDHA转染组):转染pcDNA3.1(+)-LDHA原代心肌细胞后,缺氧3h后复氧3h。然后采用酶标仪检测心肌细胞的增殖,流式细胞术检测心肌细胞的凋亡,Western blot检测细胞内蛋白表达,real-time PCR检测mRNA的表达,双荧光素酶检测目标基因。结果:1.原代心肌细胞培养72h后,酶标仪检测H/R组的原代心肌细胞的OD值为0.84±0.08,显著低于Control组(1.23±0.11),差异有统计学意义(P<0.05);原代心肌细胞培养72h后,流式细胞仪检测H/R组的原代心肌细胞的凋亡率为(44.63+7.25)%,显著高于Control组(7.12±1.82)%,两组之间有统计学差异(P<0.05)。2.原代心肌细胞培养72h后,Real-time PCR和Western blot方法检测H/R组中大鼠心肌LDHA表达量显著高于Control组,H/R组中LDHA的mRNA和蛋白水平的相对表达量分别为(9.879±2.021)和(0.988±0.114),Control组中LDHA的mRNA和蛋白水平的相对表达量分别为(2.289±1.261)和(0.287±0.165),差异均有统计学意义(P<0.05)。3.心肌细胞继续培养72h,Western blot检测结果显示,与Control组相比,H/R组中的Akt(1.098±0.274)、mTOR(1.124±0.332)和PDK1(0.934±0.246)蛋白表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。4.酶标仪检测结果显示,与H/R组(0.84±0.08)相比,H/R+LDHA转染组中OD值(1.140±0.075)显著升高,差异有统计学意义(P=0.000),表明LDHA过表达显著促进心肌细胞的增殖。流式细胞仪检测结果显示,H/R+LDHA转染组中心肌细胞凋亡率为((26.27+4.35)%,H/R组中心肌细胞凋亡率为((44.63+7.25)%,差异有统计学意义(P=0.000),表明LDHA过表达可显著抑制心肌细胞的凋亡。5.在H/R条件下心肌细胞转染LDHA过表达载体后继续培养72h,Western blot检测结果显示,与H/R组相比,H/R+LDHA转染组中的Akt(3.454±0.782)、mTOR(3.793±1.122)和PDK1(2.814±0.948)蛋白表达显著增加,差异有统计学意义(P=0.000)。6.双荧光素酶方法结果显示LDHA过表达载体转染后,相对于对照组,携带有PDK1野生型报告基因载体组的荧光素酶信号强度下降了45%,而携带有PDK1突变型报告基因载体组的荧光素酶信号强度无显著变化,表明PDK1基因是LDHA的靶点。结论:1.原代心肌细胞培养72h后,H/R组的原代心肌细胞凋亡明显增多。2.原代心肌细胞培养72h后,H/R组的原代心肌细胞中LDHA和LDHAmRNA表达增多,可能为细胞凋亡的自我保护反应。3.原代心肌细胞培养72h后,H/R组的原代心肌细胞中Akt、mTOR和PDK1蛋白表达显著增加,可能为I/R损伤致细胞凋亡的自我保护机制。4.LDHA过表达能显著增加心肌细胞中Akt、mTOR和PDK1蛋白表达,同时促进心肌细胞增殖,减少凋亡发生,说明LDHA过表达通过Akt、mTOR和PDK1蛋白起抑制心肌细胞凋亡作用。5.双荧光素酶方法证实了PDK1基因是LDHA的作用靶点。结论:1.心肌梗死存在明确的心肌细胞坏死和凋亡,并且伴有心功能的下降;再灌注时间越晚,细胞凋亡越明显;广泛前壁心肌梗死时,细胞凋亡发生显著。2.心肌I/R损伤可使心肌组织存在明显细胞坏死和凋亡,可使心肌组织中凋亡蛋白caspase-3和Bax的表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低;同时使心肌组织中LDHA和LDHAmRNA表达增加,可能与细胞凋亡关系密切。3.缺氧复氧培养可使原代心肌细胞凋亡明显增多,同时伴有原代心肌细胞中LDHA和LDHAmRNA表达增多以及AKt、mTOR和PDK1蛋白表达显著增加,可能为细胞凋亡的自我保护反应。4.LDHA过表达能促进心肌细胞中AKt、mTOR和PDK1蛋白表达增多,并且抑制心肌细胞凋亡,并且证实了PDK1基因是LDHA的作用靶点。