第一部分缺氧诱导肿瘤细胞Bcl-2时序表达促进核凝集的形成[目的]线形程序性坏死(LPPCN)是形成血管生成拟态(VM)空间结构的基础。课题组前期体内研究已观察到缺氧可使肿瘤细胞LPPCN形成增多,进而引流血液形成VM,而LPPCN的形成又与抗凋亡Bcl-2家族蛋白密切相关。为研究LPPCN样细胞形成核凝集的分子机制,探讨其与抗凋亡Bcl-2家族蛋白的关系,本部分将模拟缺氧微环境以分析缺氧条件下抗凋亡Bcl-2家族蛋白的时相表达对核凝集形成的影响。[方法]利用GasPak缺氧模型和CoCl2缺氧模型模拟肿瘤细胞缺氧微环境,以B16黑色素瘤细胞系作为模型观察核凝集出现的条件；利用伤口愈合实验、SRB实验评价缺氧对肿瘤细胞迁移、增殖的影响；利用Western Blot和Realtime-PCR分析缺氧对凋亡相关分子蛋白水平和RNA水平的影响；利用免疫荧光观察缺氧对凋亡相关蛋白表达定位的影响。[结果]1)缺氧36-48h后,采用Hochest33342活体细胞染色,荧光显微镜下观察可见约30%以上胞核呈现高度凝集状态,表现为单个凝集体或多个连接的小凝集体,未见明显的凋亡。2)缺氧可以明显抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力。3) CoCl2缺氧模型中,早期凋亡明显高于晚期凋亡,而在GasPak缺氧模型中则呈现与之相反的特点,晚期凋亡明显高于早期凋亡。4)在缺氧条件下Bcl-2和Bax表现出随时间变化的特征性表达谱。Bcl-2随缺氧时间的延长而升高,并于36h达高峰,随后表达下降；而Bax的表达则表现出与此相反的趋势。5) Caspase-3抑制剂Ac-CHO-DEVD与缺氧同时作用于肿瘤细胞时,Bcl-2和Bax在蛋白水平和RNA水平均呈现出与缺氧单独存在时相反的变化趋势。[小结]1)缺氧可诱导肿瘤细胞核凝集的出现,呈现与LPPCN细胞同样的特点；2)缺氧条件下存活的肿瘤细胞表现出更强的运动潜能；3)缺氧条件下Bcl-2家族蛋白表现出随时间变化的特征性表达谱,抗凋亡蛋白Bcl-2表达高峰的出现可能是核凝集出现的重要原因;4) Caspase-3通路阻断可以抑制细胞核凝集的出现。第二部分Bcl-2与EMT的关系：临床病理分析[目的]本部分研究通过对97例随访资料完全的人类肝细胞肝癌临床病理标本进行分析,观察抗凋亡蛋白Bcl-2与上皮-间充质转变(EMT)调控蛋白之间的关系及对临床预后的影响：初步观察Bcl-2核表达和浆表达与EMT表征蛋白(E-cadherin和β-catenin)的关系,分析Bcl-2与EMT调控蛋白(Twist-1,Twist-2, Snail)单独或共表达对肿瘤转移、血管生成及临床预后的影响,筛选对预后影响最大的共表达组合,为Bcl-2和EMT调控蛋白相互作用影响肿瘤细胞塑形及侵袭、转移能力的研究提供依据。[方法]收集天津医科大学附属肿瘤医院经手术切除标本随访资料完整并经病理医师诊断为肝细胞肝癌的病例97例,对临床病理资料和随访资料进行分析；以免疫组织化学方法检测Bcl-2和EMT相关蛋白表达,分析二者之间的相关性及其与转移、VM和临床预后之间的关系,进行统计学分析。[结果]1)97例病人中,18例(18/97,19%)具有典型的VM结构,49例(49/97,51%)存在复发与转移。2)Bcl-2表达主要位于细胞浆,部分病例中可见Bcl-2在核膜及核周聚集或核浆共表达。β-catenin非膜性表达在Bcl-2核表达阳性组(Bcl-2-Nu)阳性率明显高于Bcl-2浆阳性表达组(Bcl-2-Cyt);而E-cadherin膜表达在Bcl-2核表达阳性组(Bcl-2-Nu)阳性率明显低于Bcl-2浆阳性表达组(Bcl-2-Cyt)。3) Kaplan-Meier生存分析显示Bcl-2-Nu、Twist-1-Nu、Twist-1-Cyt和Snail表达阳性的病人生存危险度较高,差异具有统计学意义；Bcl-2-Cyt和Twist-2表达与否与生存危险度的关系无统计学意义。4) Bcl-2-Nu与EMT调控蛋白(Twist-1-Nu, Twist-1-Cyt, Twist-2和Snail)共表达均与转移相关,差异具有统计学意义；Bcl-2-Cyt与Snail共表达与转移相关,差异具有统计学意义。Bcl-2-Nu与EMT调控蛋白(Twist-1-Nu, Twist-1-Cyt, Twist-2和Snail)共表达与VM密切相关,差异具有统计学意义；Bcl-2-Cyt与EMT调控蛋白共表达与VM的相关性则无统计学意义。5)Cox逐步回归分析结果显示最终对生存预后影响最大的因素为Bcl-2-Nu&Twist-1-Cyt和Metastasis; Bcl-2-Nu(+)/Twist-1-Cyt(+)的生存危险度最高(HR=3.824),并且其危险度较二者分别单独表达的危险度(HR=2.563和HR=2.686)明显升高。6)Bcl-2最终与Twist-1在核内共表达,Bcl-2-Nu与Twist-1-Nu、VE-cad、VEGF、 HIF和MMP-9有相关性,结果具有统计学意义。[小结]1) Bcl-2-Nu与EMT表征蛋白相关,Bcl-2核表达与转移、VM相关,可导致更差的预后,提示Bcl-2核表达与HCC恶性生物学行为相关；2) Bcl-2-Nu与EMT调控蛋白共表达与转移、VM相关,影响病人生存预后,推测Bcl-2核表达与EMT调控蛋白可能存在相互作用；3) Bcl-2-Nu(+)/Twist-1-Cyt(+)共表达可能是影响HCC患者生存预后的一个独立预测指标,推测二者可能通过相互作用引发更多的生物学效应而影响肿瘤侵袭、转移及血管生成,并最终导致更差的预后；4)Bcl-2与Twist-1共表达是一个动态变化的过程,Bcl-2-Nu(+)/Twist-1-Nu(+)共表达是二者表达的最终状态。第三部分Bcl-2入核的功能研究[目的]为研究Bcl-2入核与Twist-1相互作用的分子机制,本部分将模拟缺氧微环境,观察抗凋亡蛋白Bcl-2和Twist-1蛋白表达的时序特点；利用真核过表达结合表达谱芯片和miRNA芯片分析共表达Bcl-2和Twist-1可引发的广泛的生物学效应。[方法]在体外细胞模型上,利用GasPak法模拟肿瘤细胞缺氧微环境,Western Blot和Real time-PCR观察Bcl-2和Twist-1在蛋白和RNA水平表达的特点及关系；利用全基因合成的方法获得Bcl-2和Twist-1表达质粒,单独转染或共转染获得过表达Bcl-2、过表达Twist-1和共同过表达Bcl-2/Twist-1肝癌细胞模型,在此基础上结合表达谱芯片和miRNA芯片分析共表达Bcl-2/Twist-1可引发广泛的信号转导通路改变。[结果]1)肿瘤细胞在缺氧后均呈现增殖速度降低的情况,与常氧组比较差别具有统计学意义；缺氧24h后缓解缺氧,细胞增殖速度加快,最终可以在终末时段(72h)超过常氧对照组,差别具有统计学意义；适度缺氧后缓解缺氧可以增强肿瘤细胞的增殖、运动和塑形能力。2)利用Real time-PCR和Western Blot均可以观察到细胞缺氧后24h附近可以出现Bcl-2和Twist-1的高表达峰,如果持续缺氧,表达会逐渐下降直到消失；而在24h缓解缺氧,Bcl-2和Twist-1则一致性的保持高表达。3) Bcl-2/Twist-1的共表达存在广泛的生物学效应,涉及细胞的信号转导、增殖、血管生成、细胞骨架等多方面,而不同于单独任何一者的过表达。[小结]1)缺氧条件下Bcl-2和Twist-1具有一致的表达峰；2)共表达Bcl-2和Twist-1可引发广泛的信号转导通路改变。结论本文通过模拟缺氧环境诱导肿瘤细胞Bcl-2时序表达促进核凝集的形成、Bcl-2与EMT相关蛋白的关系及Bcl-2入核的功能研究等多个角度,分析了Bcl-2经典的抗凋亡作用以外的新功能,证明其在肿瘤血管生成及肿瘤侵袭转移中也发挥了重要的作用。其中包括涉及的Bcl-2与EMT调控蛋白Twist-1相互作用诱导其入核的分子机制的研究及相应的组织、细胞在分子和功能学多角度的评价。Bcl-2与EMT关系的研究可以更好的解释在特定微环境下Bcl-2表达对肿瘤生物学行为的影响,为更全面的认识Bcl-2的功能提供了一个新的视角。同时为肿瘤细胞分化的基础研究提供了新的思路和切入点,对深入理解肿瘤细胞的生物学行为和临床诊治具有一定的价值和意义,并为抗肿瘤治疗提供了新的靶点。