形态发生因子Sonic Hedgehog的信号接收与细胞反应分子机制

来源 :南京医科大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:dalang003
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
Sonic Hedgehog (Shh)是脊椎动物中调控组织形态发生和细胞定向分化的主要形态发生因子(morphogen)之一。Shh通路突变或者调控紊乱可以引起发育畸形,并增加肿瘤发生的易感性。自1980年Hedgehog基因首次在果蝇中被发现,经过三十多年基础科学研究与临床试验,针对Shh通路的特异性抑制剂Erivedge作为治疗恶性皮肤基底细胞癌的特效药物,终于在2012年初得到美国FDA的批准。因此,深入阐明Shh的信号转导机制不仅属于当今发育遗传学研究的核心内容,同时对癌症治疗也具有实际的临床意义。在脊椎动物胚胎发育过程中,以Shh分泌细胞为中心形成的形态发生梯度(morphogenic gradient)为组织发育提供在特定轴向上的位置信息。在受Shh影响的组织发育场中,细胞据此位置信息确定今后分化的命运。在该体系中,Shh感受细胞必须能够辨别Shh形态发生梯度的细微差异,并相应调控靶基因表达。但是Shh通路的信号转导机制非常复杂,许多重要环节目前仍只被粗浅地认知。在细胞表面,Shh信号转导主要由两个跨膜受体Patched (Ptch)和Smoothened(Smo)所介导,其中Ptch是Shh的受体,可以同Shh物理结合,但对Shh通路起抑制性作用,而Smo则是通路的正向激活因子。在远离Shh信号的区域,Ptch通过目前尚不完全清楚的机制压制Smo内在活性,并促其内吞降解。在Shh信号源的附近区域,Shh与Ptch结合,从而解除Ptch对Smo的抑制,导致下游通路的激活。在通路下游,Shh靶基因的表达受转录因子Glil、Gli2和Gli3调控,其中Gli2和Gli3蛋白产物在没有或低Shh信号的情况下,经过蛋白酶体剪切加工,形成截短的转录抑制子(Gli2R和Gli3R),抑制Shh靶基因的表达。当高Shh信号出现时,Gli蛋白的酶切步骤被阻断,Gli2和Gli3可以形成全长的转录激活子(Gli2A和Gli3A),从而激活靶基因表达。Gli1不受蛋白酶加工处理,始终发挥转录激活子的作用。由这些转录抑制子和激活子混合形成的Gli蛋白转录活性梯度,是组织发育场中细胞根据Shh所提供的位置信息做出相应基因表达反应的分子调控基础。为阐明Shh通路对Gli蛋白的调控机制,本文对Gli转录因子的结合蛋白,Suppressor of Fused (Sufu),做了详细研究。Sufu是Shh通路下游一个重要的抑制因子,也是一个重要的抑癌蛋白。Sufu可以通过与Gli蛋白的物理结合,抑制Shh靶基因转录表达。我的研究显示Shh可以促进Sufu经泛素-蛋白酶体系统降解,解除其对通路的抑制作用。我发现,在Shh通路异常激活的肿瘤细胞中,Sufu蛋白稳定性有所降低,而利用Smo拮抗剂抑制肿瘤细胞Shh通路活性,可以缓解Sufu蛋白的降解水平。我进一步发现在新鲜分离的小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠胚胎组织中,激活Shh通路可以促进Sufu蛋白的降解,说明Shh对Sufu稳定性的调控机制在在体生理条件下也发挥作用。通过液相串联质谱分析,我确定了Sufu蛋白序列泛素结合位点为K257位点,并揭示当该位点突变后,Sufu变异体蛋白会变得异常稳定,具有更强的抑制Gli1转录活性的作用,同时对肺癌细胞株NCI-H322M的细胞增殖也有更强的抑制作用。脊椎动物Shh通路的一个显著特征是其转导机制对原纤毛结构的绝对依赖。自2003年Kathryn Anderson发现原纤毛结构与Shh信号转导之间的关系以来,Shh通路的多个成员,包括Sufu,被发现定位在原纤毛内。通过与实验室其他成员合作,我发现在生理条件下Shh可以促进Sufu向原纤毛转运,这一转运是以Sufu同Gli2/Gli3形成的复合体形式完成的,并且依赖于Smo活性。Sufu向原纤毛转运过程与Shh所诱导的Sufu蛋白降解代谢有着密切关系。我的实验结果显示,PKA和GSK3β蛋白激酶可以导致Sufu蛋白在S346和S342位点递次磷酸化,增强Sufu蛋白的稳定性和对转录因子Gli1的抑制活性。我们的结果还显示由PKA和GSK3β介导的磷酸化可以延长Sufu蛋白在原纤毛顶端的滞留,从而揭示了Sufu蛋白向原纤毛转运的功能意义。为进一步揭示Shh通路的信号转导机制,我们对HECT结构域泛素E3连接酶家族做了筛选研究,确立了Smurf1和Smurf2对Shh信号转导的调控作用。HECT家族E3连接酶通过识别底物的PY基序,诱导底物的泛素化修饰。在小鼠胚胎成纤维细胞内利用RNAi干扰手段将Smurf1和Smurf2敲低或者用同源重组方式同时剔出Smurf1和Smurf2基因,都可以显著阻止Smo在原纤毛中的定位,并阻断Shh信号转导反应。鼠源的Ptch1蛋白在其胞内结构域中含有两个PY基序。我的研究发现将此两个PY基序分别或同时突变后,Ptch1变异体会在原纤毛内过度聚集。我的结果进一步显示,PY基序是调控Ptch1由原纤毛外运并通过内吞途径由溶酶体降解的顺式信号,而该作用是由Smurf1和Smurf2所催化。Smurf1和Smurf2均与Ptchl有物理结合,并可能调节Ptchl泛素化修饰及其经溶酶体降解。为探讨Smurf1和Smurf2在生理条件下是否也通过Ptch调控Shh信号转导,我分离出了P6乳鼠的小脑颗粒性神经元前体细胞(granular cell precursors, GCPs),对其进行体外培养。我发现利用siRNA同时敲低Smurfl和Smurf2,将大大降低由Shh信号所维系的GCPs增殖,这说明Smurfl和Smurf2对Ptchl调节作用具有生理意义。本文通过对Shh通路抑制子Ptch和Sufu蛋白翻译后修饰的研究,阐明了Sufu和Ptch降解与由原纤毛外运的部分机制,为今后进一步探讨细胞接收和应答Shh形态发生梯度信号的调控机制,提供了新的思路。我研究所发现的调控Sufu和Ptch蛋白翻译后修饰的关键位点和蛋白分子,将会作为寻找新型小分子化合物干预Shh信号转导的崭新靶点。
其他文献
回 回 产卜爹仇贱回——回 日E回。”。回祖 一回“。回干 肉果幻中 N_。NH lP7-ewwe--一”$ MN。W;- __._——————》 砧叫]们羽 制作:陈恬’#陈川个美食 Back to yield
【正】春运期间乘坐飞机,飞机机舱内的环境可能会令乘客感到不同程度的不舒服,而患病的乘客更可能受到不好的影响。因此当您准备坐飞机旅行的时候,应防范于未然。乘飞机常见
目的:研究高度近视合并白内障超声乳化手术治疗的并发症以及术后恢复疗效。方法:对60例86眼眼轴长27.1~33.5 mm高度近视合并白内障病例开展超声乳化白内障摘除术和人工晶体植入
基于对超高层建筑特征的建筑物理分析和工程经验实践,切实做好超高层建筑的节能设计,对我国建筑节能工作有重要意义。结合某个位于夏热冬暖地区的地标类超高层建筑的节能设计
目的:探讨冠心病介入治疗经桡动脉途径的护理。方法:对经桡动脉途径冠脉介入治疗的1 892例患者的术前心理护理、用药护理等,术中桡动脉穿刺及拔管相关护理,术后对介入治疗容易
目的:比较碳酸利多卡因与盐酸利多卡因硬膜外阻滞用于剖宫产手术中的麻醉效果及对母婴的影响。方法:剖宫产手术患者80例,随机分为1.73%碳酸利多卡因组(A组)及2%盐酸利多卡因组(B组
背景及研究内容:溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是体内生理活性脂质,通过其G蛋白偶联受体(LPAR1-7)激活多条信号通路而诱导下产生诸多的细胞生理反应,参与调控细胞的