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目的纳米二氧化钛颗粒(TiO2NPs)是一种重要纳米材料,因其特殊的理化特性而被广泛应用于化工、医药、食品、电子、化妆品等诸多领域。以往有许多实验研究证实其可造成肺、肝、肾等脏器损伤。近年来有研究提示TiO2NPs可能对中枢神经系统造成损害,但目前国内外有关其神经毒性的研究多为急性毒作用效应的观察,对其神经毒性作用机制尚缺乏系统研究。本研究选用相对较低的染毒剂量和较长的染毒周期对大鼠染毒,观察在此条件下TiO2NPs的中枢神经系统毒性,并从多个途径初步探讨其毒作用机制。方法1.实验动物处理SPF级健康雄性Wistar大鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为：对照(蒸馏水)组和低(62.5mg/kg)、中(125mg/kg)、局(250mg/kg)剂量纳米二氧化钛染毒组及普通粒径二氧化钛染毒(250mg/kg)组。采用灌胃方式进行染毒,灌胃体积为lml/100g.bw,每天1次,连续染毒60d。2.常规观察指标测定a.用透射电镜对两种二氧化钛颗粒进行表征,观察二者的粒径、形状和分散情况。b.每日观察各组大鼠的一般状况,定期记录体重,大鼠处死后测定全脑、皮层及海马脏器系数。c.分离大鼠海马,留取全血样品,采用电感耦合等离子体质谱仪测定大鼠全血和海马中钛含量。3. TiO2NPs染毒对大鼠中枢神经系统毒性效应观察a.各组动物在实验结束前6天,利用Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力,记录大鼠的逃避潜伏期、总路程、平均穿越次数等指标。b.实验结束时每组随机选择2只大鼠取脑,做常规病理切片,经苏木素-伊红染色后,观察各组大鼠脑皮层和海马组织结构改变。c.采用TUNEL法观察大鼠脑皮层和海马组织神经细胞凋亡情况.4. TiO2NPs染毒对大鼠中枢神经系统毒作用机制探讨a.试验结束时断头取血,并迅速解剖取大鼠新鲜的脑皮层组织,制备大鼠血清样品和脑皮层组织匀浆,利用试剂盒测定血清中及脑皮层中T-SOD活力、GSH-Px活力、总抗氧化能力(T-AOC)和MDA含量。b.取大鼠部分脑皮层组织,制备脑细胞悬液,用Fura-2/AM的荧光探针测定大鼠脑皮层细胞内钙离子浓度。另取部分大鼠脑皮层组织,制备组织匀浆,用蛋白印迹法测定大鼠脑皮层组织calpain1蛋白含量。c.利用大鼠脑皮层组织匀浆,用蛋白印迹法测定大鼠脑皮层Bax和Bcl-2蛋白的含量。结果1.常规观察指标a.两种类型的二氧化钛颗粒均为类球形的多面体,二者均可见部分颗粒形成松散的团聚体；纳米二氧化钛颗粒粒径约20～60nm,普通粒径的二氧化钛颗粒粒径约100-300nm。b.各组大鼠一般状况良好。高剂量组大鼠全脑脏器系数与对照组比较显著下降(P<0.05),其余指标各组与对照组比较均无显著变化(P>0.05)。c.与对照组比较,各组全血和海马中钛含量均显著升高(P<0.05)；高剂量组与普通粒径组比较,全血钛含量显著升高(P<0.05),海马钛含量无显著变化(P>0.05)。2. TiO2NPs染毒对大鼠中枢神经系统毒性效应a.定位航行实验中,与对照组比较,高剂量组第3、4天逃避潜伏期较高(P<0.05)；中剂量组第3天逃避潜伏期高于对照组(P<0.05)；中、高剂量组第3天总路程高于对照组(P<0.05)；其余各天各组总路程和逃避潜伏期均无显著变化(P<0.05)。高剂量组与普通粒径组比较,第4天逃避潜伏期较高(P<0.05),其余各天各指标均无显著变化(P>0.05)。空间探索实验中,与对照组比较,高剂量组平均穿越次数与周边活动路程均较低(P<0.05),中剂量组周边活动路程低于对照组(P<0.05)；其余各组各指标均无显著变化。高剂量组与普通粒径组比较,平均穿越次数较低(P<0.05)；其余各指标均无显著变化(P>0.05)。b.病理切片可见,各纳米二氧化钛染毒组大鼠脑皮层和海马神经细胞均出现不同程度的细胞密度降低、核固缩、染色质溶解等现象,且随染毒剂量增大损伤越明显,中、高剂量组海马组织门区还可见液化性坏死。普通粒径组脑皮层和海马组织结构基本正常,仅见轻度损伤,核固缩和染色质溶解现象较轻,颗粒细胞下层也可见液化性坏死。c. TUNEL结果显示,与对照组比较,高剂量组皮层和海马TUNEL阳性细胞数均升高(P<0.05)；普通粒径组海马TUNEL阳性细胞数与对照组比较也出现升高(P<0.05)。高剂量组与普通粒径组比较,皮层和海马TUNEL阳性细胞数均升高(P<0.05)。3. TiO2NPs染毒对大鼠中枢神经系统毒作用机制的探讨a.皮层组织氧化应激指标显示,与对照组比较,高剂量组T-SOD活力下降(P<0.05)；中、高剂量组MDA含量升高(P<0.05)；其余各组各指标与对照组比较均无显著变化(P<0.05)。高剂量组与普通粒径组比较,MDA含量升高(P<0.05)；其余各指标均无显著变化(P>0.05)。血清氧化应激指标显示,与对照组比较,高剂量组T-SOD活力下降(P<0.05)；其余各组各指标均无显著变化(P>0.05)；高剂量组与普通粒径组比较各指标均无显著变化(P>0.05)。b.大鼠脑皮层细胞内钙离子浓度指标中,与对照组比较,高剂量组细胞内钙离子浓度升高(劂.05)；其余各组均无显著变化(P>0.05)。高剂量组与普通粒径组比较细胞内钙离子浓度无显著变化(P>0.05)。WesternBlot检测结果显示,与对照组比较,各组calpain1表达均无显著变化(P>0.05)。c. Western Blot检测结果显示,与对照组比较,高剂量组和普通粒径Bax表达均升高(P<0.05)；低剂量组与高剂量组Bcl-2表达均降低(P<0.05)；其余各组各指标均无显著变化(P>0.05)。结论1. TiO2Nps经灌胃染毒后,可进入大鼠血液及海马组织中并产生蓄积。2. TiO2Nps染毒可使大鼠空间学习记忆能力下降,造成大鼠脑皮层和海马组织损伤,诱导大鼠脑皮层和海马组织神经细胞凋亡。3. TiO2Nps可引起大鼠脑皮层细胞内钙超载,但在本实验条件下脑皮层组织calpain1的表达未见显著改变。4. TiO2Nps的中枢神经系统毒性可能与脑组织内氧化应激增强、细胞内钙超载及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平的改变有关。