血液净化技术是一种利用膜分离或吸附分离原理清除病人血液中内源性、外源性毒素的治疗技术,在肝衰、肾衰、脓毒血症等危重病症的治疗中发挥关键作用。相对于水溶性小分子毒素,中大分子蛋白类血液毒素的有效清除是目前本领域的技术难点。基于固定化抗体为配基的免疫亲和吸附技术能够在复杂的血液体系中高特异性识别和清除特定蛋白毒素,具有安全、高效的特点,是新一代特异性血液净化材料的发展方向。本论文针对导致终末期肾病患者发生透析相关淀粉样变（dialysis-related amyloidosis,DRA）的关键致病因子一β2微球蛋白（β2-microglobulin,β2M）,以生物高分子材料-纳米抗体为功能配基,发展了一种基于纳米抗体的特异性血液净化吸附剂。论文从提高固定化纳米抗体的抗原结合活性出发,通过对不同物种来源纳米抗体结构中所带氨基和巯基的差异分析,指导纳米抗体的种属选择;在此基础上,构建β2微球蛋白纳米抗体噬菌体展示文库并从中筛选获得特异性纳米抗体;分别对纳米抗体的氨基和巯基偶联进行系统研究,通过固定化方法优化获得高性能血液净化吸附材料,具体结果如下:（1）不同物种来源的纳米抗体结构差异分析。氨基和巯基是蛋白固定化中最常使用的功能基团,但氨基和巯基在蛋白质结构中所处的位置对其偶联后的结合活性保持率至关重要。为了详细了解不同物种来源纳米抗体的结构特征,通过数据库检索,建立了属于骆驼族（C.bact和C.drom）和美洲驼族（L.glam和V.paco）共4个物种来源的纳米抗体氨基酸序列库,并对其氨基、巯基的数量和位置进行比对分析。结果表明:①4个物种来源纳米抗体的氨基酸序列存在较高的保守性,骆驼族来源和美洲驼族来源的纳米抗体非保守区的氨基酸残基种类差异显著。②纳米抗体上存在4个保守性大于80%的赖氨酸位点:H43、H64、H72和H83,至少90%的纳米抗体含有3个以上的赖氨酸残基,其中C.drom来源的纳米抗体含有的平均赖氨酸残基数量及CDR区赖氨酸残基数量显著多于其他3个物种。③所有纳米抗体在H22和H93间存在一个严格保守的二硫键,46%的骆驼族来源的纳米抗体在H33和CDR3间存在第2对二硫键。仅有26.4%的V.paco来源的纳米抗体及6.6%的L.glam来源的纳米抗体含有第2对二硫键,并且成键位置位于H50和CDR3之间。此外,仅有5.0%的L.glam来源纳米抗体含有游离巯基。基于大部分L.glam来源的纳米抗体仅含有1对二硫键,不含游离巯基,且氨基数量较少,因此预测构建该物种来源的纳米抗体库将更有利于获得适于定点偶联制备免疫吸附剂的纳米抗体。（2）噬菌体展示纳米抗体文库的构建和筛选。以β2M免疫L.glam,构建了 M13噬菌体展示纳米抗体文库,库容达到4.3×107cfu;16个随机克隆中,阳性插入率为100%,多样性达到100%。M13噬菌体展示纳米抗体文库滴度为2.6×1012 cfu/mL,满足实验要求。经过三轮生物淘选和测序分析,共获得20个不同序列,可划分为9个家族的纳米抗体。在每个家族中挑选1个克隆构建了表达菌株,并纯化制备纳米抗体,测定了其与β2M的亲和力,其中纳米抗体R15与β2M的亲和力达到16.8 nM。（3）纳米抗体的氨基修饰对其结构和功能影响。为了探究纳米抗体表面氨基是否存在反应活性偏好,进而实现基于氨基的定点修饰和偶联,挑选了4个具有不同氨基分布的纳米抗体作为模式蛋白,研究了氨基修饰对纳米抗体的结构和功能的影响,结果表明:在氨基修饰中,纳米抗体上的不同位点氨基的反应效率不同,保守位点中的H0、K83的氨基反应效率较高,可达到50%～90%,而K43、K64和K75的反应效率低于20%,但即便如此,仍然难以仅通过反应条件的控制实现均一性较高的单点氨基修饰。此外,对修饰产物的结构和功能分析表明,氨基修饰造成纳米抗体有不同程度的稳定性降低、空间结构改变及抗原结合能力减弱,不同纳米抗体的受影响程度具有显著差异。（4）特异性β2M血液净化吸附材料的合成与评价。进一步通过研究纳米抗体偶联方式对吸附剂性能的影响,发现碳端巯基定点偶联的纳米抗体,其亲和力和活性保持率显著优于表面氨基随机偶联,在纳米抗体偶联密度相近时,巯基定点偶联纳米抗体吸附剂的β2M结合能力高于氨基偶联25%以上。因此利用碳端巯基标签定点偶联纳米抗体,制备了 β2M特异性免疫吸附剂,进一步考察了其结合目标分子的热力学、动力学特征,并通过建立体外灌流模型评估了其作为血液净化材料的潜在临床效果。结果表明纳米抗体在琼脂糖凝胶介质上的偶联密度可达到15.3 mg/mL,偶联效率为51.0%,此时吸附剂上74%的纳米抗体具有抗原结合活性。所制备的免疫吸附剂的吸附容量高达7.8 mg/mL,为文献报道的19倍。体外灌流实验表明,使用150mL吸附剂,一次治疗可以使病人体内β2M浓度下降到健康水平（<10 μg/mL）。此外,实验表明该吸附剂对血浆蛋白质没有显著的非特异性吸附且重复使用性良好。综上,本研究表明筛选和制备特异性纳米抗体用于新型血液净化吸附材料的研制是一种可行的技术策略。相对于普通抗体,以纳米抗体为亲和配基的吸附材料在保持高亲和、高特异性的同时能够发挥其分子小、结构稳定、易于原核表达等性能和成本优势,具有良好的应用前景。