【摘 要】
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本实验室从人参根际土壤分离获得一株对人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)具有拮抗作用的菌株NT35,该菌株对多种病原真菌具有很强的抑制作用,有广谱抗性。本试验旨在对菌株NT35抗菌物质进行分离纯化,探究其抗菌物质特性,提高菌株的生物防治效果,为其在人参病害上的应用奠定基础。主要研究结果如下:1、菌株NT35抑菌活性的测定及鉴定该菌株对多种病原真菌显示出抑菌活性,具有
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本实验室从人参根际土壤分离获得一株对人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)具有拮抗作用的菌株NT35,该菌株对多种病原真菌具有很强的抑制作用,有广谱抗性。本试验旨在对菌株NT35抗菌物质进行分离纯化,探究其抗菌物质特性,提高菌株的生物防治效果,为其在人参病害上的应用奠定基础。主要研究结果如下:1、菌株NT35抑菌活性的测定及鉴定该菌株对多种病原真菌显示出抑菌活性,具有广谱抗菌性;田间防治试验表明菌株NT35发酵液(1.5×10~7cfu/m L)对人参锈腐病的防治效果高达68.79%;通过对其进行形态特征观察、生理生化试验及16S r RNA测序分析,鉴定菌株NT35为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。2、发酵液的制备及粗蛋白的获得种子液制备:NT35平板打两个菌碟,接入种子培养基,温度28℃,转速160rpm,培养12h;发酵液制备:按6%的接种量,接入发酵培养基,温度34℃,转速180rpm,装液量50/250,摇瓶培养72h。用30%硫酸铵对20L发酵液进行沉淀处理,后经透析袋(3500)脱盐处理24h,最终获得7.946g粗蛋白。3、粗蛋白稳定性的测定粗蛋白耐高温,20-100℃条件下均有抗菌活性;耐酸碱,在p H4-10条件下均具有抗菌活性;在30W紫外灯照射条件下具有抗菌活性;经过蛋白酶K(终浓度100μg/m L)和氯仿处理后失活。4、抗菌蛋白的分离纯化采用脱盐柱Sephadex G-25、离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow和Q Sepharose HP,凝胶柱Superdex75等,获得具有拮抗人参锈腐菌能力的天然蛋白1-4-2F和1-5-1F;经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,其分子量分别为6.5 KDa和3.3KDa。5、抗菌蛋白的质谱鉴定1-4-2F质谱鉴定:选择综合得分最高、登录号为ATX84098.1的蛋白作为目的蛋白,该蛋白分子量为10.176KDa,等电点9.08,覆盖率达到49%,该蛋白为未注释功能蛋白(Uncharacterized protein);1-5-1F质谱鉴定:质谱结果中蛋白测序太少,且score值偏小、分子量相差大、覆盖率偏低,未找到相应匹配蛋白。6、拮抗蛋白1-4-2F对菌丝生长的影响蛋白1-4-2F对人参锈腐菌菌丝有拮抗作用,导致锈腐病菌丝杂乱,细胞畸变、囊泡、膨胀,细胞壁损坏,原生质泄露,继而菌丝断裂消融。本试验分离纯化出一种抗人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)相关蛋白,为贝莱斯芽孢杆菌的生防应用提供理论依据,为发掘抗病相关基因和研究抗病机理奠定基础,对生防菌的改造及药剂多样性的开发做出贡献。
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