论文部分内容阅读
甘薯茎线虫病是制约我国甘薯生产的三大严重病害之一,近年来已成为北方薯区最严重的病害。传统防治甘薯茎线虫病的方法主要有轮作换茬、药剂防治和选育抗病品种等,但因其高投入低效率和产生的环境问题而暴露出很大的局限性。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)由于其特异性的高毒力、对人畜无害和不污染环境等特点,作为农业生产上防治植物寄生线虫的微生物杀虫剂已得到一定应用,但是到目前为止利用Bt防治甘薯茎线虫的研究却未见公开报道。本研究以已经报道的对一些动植物寄生线虫有活性的Bt菌株为供试菌株,筛选得到了对甘薯茎线虫具有高毒力的YBT-008菌株,利用SDS-PAGE、LC-MS和PCR等方法验证了YBT-008可编码的四个杀虫晶体蛋白基因cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba,进而构建重组载体并使其表达,最后分别测定了已表达蛋白对甘薯茎线虫的杀虫活性,旨在寻找到杀甘薯茎线虫的Bt新型基因和蛋白资源。1.筛选了一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008。初筛以已经报道的对动植物寄生线虫有活性的12株Bt菌株为供试菌株,提取其杀虫晶体蛋白,分别测定在3d和7d时对供试线虫的致死率；初筛得到了三株对供试线虫致死率在50%以上的Bt菌株；将其生测样品稀释两倍后,按同样方法进行生物测定,此为复筛。通过初筛和复筛我们得到了一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008,相较其余菌株杀虫效果明显,其对甘薯茎线虫的LC50值为203.76μg/mL。2.验证了YBT-008可编码的四个杀虫晶体蛋白基因。镜检观察到YBT-008在芽胞形成过程中可形成具明显形态特征的伴胞晶体蛋白,通过SDS-PAGE和LC-MS分析,鉴定出YBT-008可产生Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aa和Cyt2Ba四种杀虫晶体蛋白：设计特异性引物对,对上述四个杀虫晶体蛋白基因的PCR扩增进步验证了YBT-008基因组内含有cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba杀虫晶体蛋白基因。3.克隆并表达了cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba四个杀虫晶体蛋白基因。设计带酶切位点的特异性引物扩增上述四个基因的全长编码序列,将其连接到穿梭载体pHT304上,并转化到Bt无晶体突变株BMB171中,镜检和SDS-PAGE结果表明上述四个蛋白均已获得表达。4.检测了Cyt2Ba和Cry4Ba对甘薯茎线虫的杀虫活性。提取上述表达成功的晶体蛋白,分别检测了其对甘薯茎线虫的杀虫活性,结果表明Cyt2Ba在3d和7d时的杀虫效果明显,Cry4Ba的杀虫效果并不明显；因Cry11Aa和Cry4Aa的表达量不高,因此其表达系统还有待于进一步的优化,然后再检测其杀虫活性。