前言:胃癌在世界范围内属于最常发生的癌症之一,有着很高的发病率和死亡率。最新的全球范围内癌症数据统计显示,胃癌发病率在所有恶性肿瘤中位居第五位,死亡率位居第三位。在全球胃癌发病率的地区分布上来看,东亚地区依然是全球胃癌的高发地区,其中尤其以我国的胃癌发病率最高。近年来,随着早期诊断、手术治疗、辅助治疗及靶向治疗的发展,胃癌患者的生存有一定程度的改善,但是远期预后效果仍不乐观,胃癌依然严重威胁国人的健康。因此,对于胃癌早期诊断以及胃癌发生发展的探索,寻找胃癌早期诊断和精准治疗的有效生物标志物显得极为迫切。肾连蛋白（Nephronectin,NPNT）是一个首次在小鼠胚胎肾脏中新发现的细胞外基质蛋白,其分子量在70-90kD,可以作为整合素α8β1的配体。NPNT蛋白由561个氨基酸组成,包含表皮生长因子样结构域、RGD（Arg-Gly-Asp）序列和带COOH-末端的MAM域。在生理状态下,NPNT蛋白在很多方面发挥了重要的作用,包括调控肾脏的发育、成骨细胞的分化、骨组织血管再生,以及组织损伤修复等。近年来,一些研究陆续报道了NPNT蛋白在多种肿瘤中的异常表达,提示NPNT可能在肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用。乳腺癌领域的研究发现NPNT在乳腺癌中高表达,且能够促进乳腺癌细胞的粘附和体外生长能力,体内动物实验也证实NPNT能够促进乳腺癌细胞的肺定植转移。然而,与此相反,一些研究发现NPNT在黑色素瘤中呈现低表达。研究发现黑色素瘤中,相比于正常的皮肤组织,NPNT在蛋白和mRNA水平都在呈现低表达。并且在黑色素瘤细胞系中,NPNT的表达也呈现低表达,功能实验结果证实NPNT能够抑制黑色素瘤细胞的迁移能力。上述研究提示NPNT在各癌症组织中的表达可能呈现组织特异性,其在肿瘤中发挥的作用仍然存在争议。我们查阅了NPNT与胃癌的相关研究,发现目前尚无研究报道NPNT在胃癌中的表达情况以及NPNT对胃癌的发生发展可能具有的调控作用。因此,探索NPNT在胃癌组织中的表达情况以及它在胃癌中可能具有的调控功能具有重要的意义。基于此,在本研究中,我们首先利用公共数据库分析NPNT在胃癌组织中的表达情况,并且分析NPNT的表达与预后的关系。随后,我们利用自己本单位的组织标本检测NPNT的表达水平,并分析其表达与临床病理资料及预后之间的关系,进而阐明NPNT在胃癌组织中的表达特性。进一步通过一系列功能实验证实NPNT在胃癌中可能发挥的功能作用及其可能发挥作用的信号通路。研究方法:1、公共数据库:本研究使用Oncomine、GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）、UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）、K-M Plotter（Kaplan Meier Plotter）数据库（http://kmplot.com）等分析NPNT在胃癌组织中表达情况,及其与胃癌病人预后的关系。2、临床标本:标本来源于自2009年1月到2011年12月在中国医科大学第一附属医院胃肠肿瘤外科接受胃癌根治性手术的117名胃癌患者的术后病理标本和对应的73例癌旁非癌胃黏膜标本。与此同时,我们收集整理这些病例的临床病理信息以及完善的随访资料。所有的临床组织标本在收集前均已获得患者知情同意,并且也通过了中国医科大学附属第一医院医学科学研究伦理委员会的批准。纳入患者均符合以下条件:1)患者在术前未接受任何放疗或者化疗;2)所有患者均接受胃癌根治性手术及标准淋巴结清扫术;2)所有手术切除标本均经病理学证实为胃癌;3)纳入患者具备完整的临床病理资料。3、免疫组化:免疫组化采用常用的S-P法。应用双半定量评分法判定免疫组化染色结果,评分标准如下:染色强度（0,未染色;1,弱染色;2,中度染色;3,强染色）,染色阳性细胞率（0,≤5%;1,6-25%;2,26-50%;3,51-75%;4,>75%）。染色强度评分与染色阳性细胞率评分相乘得到的数值即为染色评分结果值。4、细胞培养:人胃癌细胞系BGC-823、MGC-803、SGC-7901及正常胃黏膜上皮细胞系GES-1均购于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所,AGS细胞系购自于美国ATCC细胞库。所有细胞均培养于37℃,含5%CO₂且湿度饱和的孵箱。5、RNA提取、反转录及实时定量PCR:细胞RNA应用TRIzol试剂提取,使用微量分光光度计测RNA浓度及纯度,检测结果A260/A280值在1.9-2.0之间表示RNA纯度较高。采用Takara反转录试剂盒对RNA进行反转录,应用SYBR法在LightCycler?480ⅡReal-time PCR仪上进行实时定量PCR反应。实时定量PCR结果以GAPDH作为内参,采用2^-ΔΔCT法计算结果。6、蛋白提取、定量及western blot:应用凯基全蛋白提取试剂盒提取胃癌细胞全蛋白,然后利用BCA蛋白定量法进行蛋白定量。进一步利用western blot检测各实验组之间蛋白的差异表达。7、细胞增殖实验:采用Cell Counting Kit-8（CCK8）法进行检测细胞增殖,于96孔板每孔接种2500个细胞,在第0小时、24小时、48小时、72小时、96小时加入CCK8试剂,孵育1小时后进行吸光度检测,记录结果并绘制生长曲线。8、Transwell细胞侵袭及迁移实验:应用transwell实验检测细胞侵袭能力,将基质胶与RPMI-1640培养基按1:10进行稀释,取50μL均匀铺于transwell小室,4小时后每孔加入200μL含5万细胞的悬液,将transwell小室置于含10%血清的培养基中进行培养,24小时后进行染色,细胞计数。应用transwell实验检测细胞迁移能力时不需要铺基质胶,其他步骤与侵袭实验一致。9、统计学分析:所有的统计学分析都使用SPSS V19.0（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）软件及GraphPad Prism V8.0软件完成。应用卡方检验分析NPNT在胃癌组织和癌旁非癌组织中的差异表达。采用非参数检验统计NPNT表达与临床病理资料之间的关系,其中两组比较采用Manner-Whitney U检验,多组比较采用Kruskal-Wallis H检验。采用Kaplan-Meier法计算总体生存率,并使用log-rank检验评估差异。计量资料结果用均数±标准差（Mean±SD）表示,P<0.05则认为有显著性差异。结果:1、NPNT在胃癌中高表达:Oncomine和GEPIA数据库分析提示NPNT在胃癌组织呈现高表达。利用KM-Plotter分析NPNT表达与胃癌病人预后的关系,结果发现胃癌病人高表达NPNT预后明显差于低表达病人。免疫组化结果也提示NPNT在胃癌组织中阳性表达率（40.17%,47/117）明显高于癌旁组织中的阳性表达率（10.96%,8/117）。2、NPNT在胃癌中高表达与胃癌病人的不良预后明显相关:首先利用KM-Plotter分析NPNT表达与胃癌病人预后的关系,结果发现胃癌病人高表达NPNT预后明显差于低表达病人。进一步,我们利用Kaplan meier法在本单位队列中分析了NPNT表达与预后的关系,发现NPNT的表达与预后呈显著相关性（p=0.0032）。胃癌病人高表达NPNT预后相比低表达者明显差。3、NPNT促进胃癌细胞的增殖:利用构建成功的NPNT稳定过表达、稳定敲减胃癌细胞及各自对照组细胞,采用CCK8方法检测NPNT对于胃癌细胞增殖的影响。结果发现NPNT敲减细胞增殖能力明显低于对照组细胞（p<0.05）,相反,过表达NPNT能够明显促进胃癌细胞增殖（p<0.05）。4、NPNT促进胃癌细胞的迁移及侵袭能力:利用构建成功的NPNT稳定过表达、稳定敲减胃癌细胞及各自对照组细胞,采用transwell方法检测NPNT对于胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响。结果发现NPNT敲减细胞迁移和侵袭能力明显低于对照组细胞（迁移:122±10.81 VS50.67±5.51,p<0.05;侵袭:32±3VS 17.33±3.21,p<0.05）,相反,过表达NPNT能够明显促进胃癌细胞迁移及侵袭能力（迁移:204±6 VS125±10.78,p<0.05;侵袭:65±7.55 VS 23.33±7.77,p<0.05）。5、干预NPNT在转录和翻译水平平影响EMT相关指标的表达:定量PCR结果显示降低胃癌细胞中NPNT的表达可以显著减少间质表型相关标志物N-cadherin、Vimentin、ZEB2、SNAI1及侵袭相关指标MMP9的表达,过表达NPNT上调Twist1、Vimentin、ZEB2、SNAI1、MMP9表达。Western blot检测结果显示降低胃癌细胞中NPNT的表达可以在翻译水平降低间质表型相关标志物N-cadherin、ZEB2、Vimentin、SNAI1及侵袭相关指标MMP9的表达,过表达NPNT上调间质表型相关标志物N-cadherin、ZEB2、Vimentin、SNAI1及侵袭相关指标MMP9的表达。6、NPNT对胃癌细胞周期的影响:利用PI染色检测细胞悬液中G1期、S期、G2/M各细胞周期的细胞比例。统计结果显示,NPNT敲减没有明显改变细胞周期进展。相反,过表达NPNT对于胃癌细胞周期进展无明显影响。7、NPNT可能通过激活PI3K-Akt信号通路影响胃癌细胞生物学行为:干预胃癌细胞中NPNT的表达,检测PI3K-Akt信号通路下游磷酸化Akt的表达变化,结果发现敲减NPNT能够降低p-Akt的水平,相反,过表达NPNT能够升高胃癌细胞中p-Akt的表达水平。结论:1、生物信息学分析提示NPNT在胃癌组织中高表达,并且高表达与胃癌病人不良预后正相关。2、免疫组化分析结果显示NPNT在胃癌组织中呈现显著高表达,且与胃癌病人的T分期、TNM分期呈显著正相关,与胃癌病人的不良预后正相关。3、NPNT能够促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭。4、NPNT能够促进间质相关标志物的表达以及侵袭相关标志物的表达。5、NPNT可能通过调控PI3K-Akt信号通路,影响胃癌的进展。