【摘 要】
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乙醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）是人体乙醇代谢的关键酶之一，人体内乙醇由乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）氧化为乙醛，乙醛在ALDH的作用下氧化为乙酸，并进一步生成乙酰辅酶A进入其他代谢途径。多数中国人体内ADH含量和酶活较高，而ALDH酶活低得多。醉酒和很多酒精性疾病都与ALDH的缺乏有关。本课题的主要研究内容是利用毕赤酵母高效表
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乙醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）是人体乙醇代谢的关键酶之一，人体内乙醇由乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）氧化为乙醛，乙醛在ALDH的作用下氧化为乙酸，并进一步生成乙酰辅酶A进入其他代谢途径。多数中国人体内ADH含量和酶活较高，而ALDH酶活低得多。醉酒和很多酒精性疾病都与ALDH的缺乏有关。本课题的主要研究内容是利用毕赤酵母高效表达人乙醛脱氢酶2（Aldehydedehydrogenase2，ALDH2），以用于酒精解毒或其他研究。本实验室已构建的含有密码子优化的人ALDH2的质粒pPIC9K-07ALDH2的基础上，去除信号肽α-factor得到质粒pPIC9K-ALDH2-delsign，然后用电转导的方法将该质粒电转化到毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168中，构建得到基因工程菌株P. pastorisSMD1168（pPIC9K-ALDH2-delsign）。并利用该菌株进行了摇瓶和发酵罐表达。摇瓶表达的诱导条件为28℃，pH7.0，初始OD600=15，诱导72h，每24h补加甲醇1.2%。48h时每mL发酵液中ALDH酶活为0.315U。发酵罐表达采用5L发酵罐。采用如下工艺：甘油生长阶段pH5.5，温度30℃，通气量3L/min，溶氧（Dissolved oxygen，DO）30%，转速与DO关联；甘油流加阶段，以25mL/h的速度流加500mL50%甘油，此过程中pH5.5，温度30℃，通气量3L/min，DO为30%，转速300-1050r/min。DO与转速关联；碳源饥饿1h，pH5.5，温度30℃，通气量3L/min，DO不控制，转速800r/min；甲醇流加阶段，pH7.0，温度25℃，通气量4L/min，DO20%，甲醇流速与DO关联，转速800r/min。在上述条件下发酵得到如下结论：在甘油生长阶段在第18.9h时基础盐培养基中甘油消耗完，酵母生物量达到4.26g/L（OD600=14.17）；甘油流加阶段结束时酵母生物量达到96.19g/L （OD600=319.18）；诱导阶段生物量变化不大，70h时达到最大120.42g/L （OD600=399.58），之后进入衰亡期，生物量逐渐下降。发酵总共进行了100h，85.9h时发酵液中乙醛脱氢酶活性最高，每mL发酵液中人ALDH2的表达量为193.88mg/L，酶活为0.944U，比活为4.87U/mg。
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