前言:骨肉瘤是常发生于青少年的长骨干骺端的原发恶性骨肿瘤之一,其恶性程度很高,外科手术不能够完全的单一解决问题。近几十年内骨肉瘤的诊断与治疗取得了长足的进展,但是骨肉瘤的总体生存率仍无明显变化。尤其是原发骨肉瘤向邻近组织器官的转移,一直是制约骨肉瘤治疗和生存的主要问题。因此,我们对骨肉瘤转移的机制的关注是我们研究的方向。肿瘤的侵袭转移过程包括细胞黏附、细胞增生、细胞运动、细胞外基质降解、机体免疫、肿瘤血管生成等多个环节,其过程复杂多样。近年伴随着对肿瘤基因环境的探究,越来越多的物质参与着肿瘤的侵袭及转移。特别是肿瘤微环境中的相关炎性因子等在肿瘤微环境中的作用值得我们深入研究。脂多糖(Lipopolysacoharides,LPS),是革兰氏阴性杆菌细胞壁最外层一层较厚的类脂多糖类物质,在肿瘤微环境中发挥着重要的作用,能够通过活化细胞表面的Toll样受体,进而影响肿瘤的侵袭及转移。尤其是LPS能够活化上皮细胞向间质细胞的转化过程,进而参与肿瘤的侵袭及转移。EMT是指上皮细胞通过特定程序,失去极性和细胞间连接,致使浸润和迁移能力增强,向间质表型细胞转化的生物学过程,在肿瘤转移中被看作是重要的病理过程,其主要特征有细胞黏附分子E-cadherin表达的减少,同时可引起间质表型α-SMA,N-ca,Snail等基因表达的上调。因此可以通过检测这两类细胞表面特异性表达产物来鉴定EMT的发生。越来越多的研究表明,EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤的细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学基础。研究表明多种因子参与了EMT过程,特别是近年发现的非编码RNA,通过调控EMT在肿瘤侵袭及转移中发挥了重要作用得到大家的关注。ncRNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA,从长度上划分可分为长链非编码RNA(>200nt)以及微小RNA(MicroRNA,miRNA,<200nt)等等。随着人们对ncRNA进一步认识,越来越多的研究表明ncRNA在生命活动中以及在疾病发生发展过程中均发挥了重要的作用。特别是近年对lncRNA深入研究,我们发现lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要的作用,成为遗传学研究的热点。特别是lncRNA在肿瘤中的作用,值得我们进一步深入研究。lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,参与了X染色体沉默,基因组印记以及染色质修饰,转录激活与干扰,以及核内运输等多种重要的生物学调控过程。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)存在于HOX基因中,是第一个被发现具有反式作用的lncRNA。2007年开始陆续有HOTAIR在多种肿瘤中均发挥重要的调控作用,Ding等研究证实HOTAIR能够促进肝癌细胞的侵袭与迁移。Xu ZY等的研究发现胃癌中HOTAIR的缺失能够抑制胃癌的侵袭。Chang等研究证实在原发性乳腺癌及侵袭性乳腺癌的临床样本中都提示有HOTAIR的高表达,体外实验中发现过表达HOTAIR会使肿瘤细胞的侵袭性增强,沉默HOTAIR会抑制细胞肿瘤细胞的生长。这是首次将肿瘤恶性表型与HOTAIR的关联研究。但是,目前对HOTAIR的研究参与肿瘤发生发展的具体作用机制尚不清楚。HOTAIR与骨肉瘤的研究鲜有报导,截止至2018年1月,在PUBMED检索以HOTAIR和Osteosarcoma主题词,只有5篇研究论文和文献综述,除外一篇是本文正在研究的关于LPS通过TLR4/HOTAIR促进骨肉瘤的侵袭和迁移,再无其他关于LPS对骨肉瘤的作用机制的研究。在骨肉瘤的研究中,LPS对骨肉瘤的侵袭及转移有影响,这种影响与HOTAIR究竟有何种关系值得我们进一步研究。既往的研究表明,lncRNA在肿瘤中存在的异常表达,并且经过不同的信号通路来进一步参与肿瘤细胞的侵袭及转移。对肿瘤相关信号通路的深入研究不仅有助于我们了解肿瘤的发生和发展过程,还可以通过靶向治疗来干扰该通路,为临床提供更为有效的治疗手段。MAPK途径的研究多采用表达、显性失活、基因沉默等研究方法。MAPK信号通路主要有4种类型。用它们的核心命名为MAPK,参与了多种生理及病理活动的调节,通路之间可以整合交叉,MAPK途径信号的强弱和活化程度决定细胞未来的命运。MAPK信号转导通路通过级联的磷酸化反应效应来转换细胞外信号。因此,严格的规定这些信号途径是必不可少的,正常细胞功能于放松管制导致各种疾病包括肿瘤。三个主要的MAPK家族已发现与癌症有关联,分别为ERK(ERK1/2)、p38MAPK和Jun氨基末端激酶(JNK)。在非转化细胞中ERK1/2主要涉及themitogenesis反应而p38MAPK和JNK介导细胞应激与炎症反应有关。LncRNA HOTAIR是否通过MAPK信号通路发挥作用值得我们进一步研究。本研究拟通过在细胞培养过程中加入LPS,以及临床病理组织相关实验观察LPS对骨肉瘤的侵袭转移的影响,并探讨LPS是否通过HOTAIR来实现对骨肉瘤侵袭转移,进而为骨肉瘤的治疗提供更多的理论依据。目的:本研究以骨肉瘤细胞MG63与Saos-2为研究对象,通过LPS诱导作用,明确LPS促进骨肿瘤侵袭转移及发生EMT的机制,以此为进一步探讨且证实其发挥作用的机制是通过lncHOTAIR调控ERK1/2通路来实现的;并且通过检测骨肉瘤组织中TLR4、HOTAIR及信号传导通路MAPK的相关表达,探讨其在骨肉瘤组织中的表达情况及其与临床病理参数之间的关系,以期为骨肉瘤的治疗提供新的理论依据。研究方法:首先在骨肉瘤细胞培养的过程加入LPS,找到LPS对骨肉瘤细胞系生长的最佳作用浓度与时间;并通过LPS作用骨肉瘤细胞在不同时间收集细胞,提取蛋白、RNA,用Western blot与real-time RT-PCR法检测上皮表型标志E-cad、间质表型标志N-cad,VIM以及a-SMA的表达;TLR4是LPS的受体,为进一步研究LPS的作用机制将TLR4用RNA干扰的方法进行抑制,Western blot检测蛋白的表达情况;前面的体外实验证实在骨肉瘤细胞中,LPS能够通过TLR4介导的跨膜作用,进而活化p-ERK1/2通路,从而实现对骨肉瘤细胞侵袭及转移以及EMT的发生。结果:1、LPS促进骨肉瘤细胞的侵袭转移LPS在多种肿瘤中均发挥重要的促进侵袭转移的作用,但是在骨肉瘤中,LPS的作用尚未完全阐释清楚。我们通过Transwell实验检测LPS对骨肉瘤细胞系MG63与Saos-2的侵袭转移的影响。结果提示LPS诱导24小时后,骨肉瘤细胞系的侵袭转移能力显著增加,说明LPS能够促进骨肉瘤细胞的侵袭及转移。2、LPS促进骨肉瘤细胞EMT的发生为了明确LPS能否促进骨肉瘤细胞EMT的发生,我们通过已知的EMT标志基因表达进行验证。首先通过real-time RT-PCR结果显示经过LPS(10μg/ml)处理24小时后,骨肉瘤细胞中的上皮标志的基因E-cadherin的表达较对照组有显著降低,而间质标志基因N-cadherin,vimentin与α-SMA表达明显升高。同时,我们还通过Western blot检测E-cadherin,N-cadherin,vimentin与α-SMA蛋白的表达情况,结果显示经过LPS处理48小时后,骨肉瘤细胞中的上皮标志蛋白E-cadherin的表达降低明显,而间皮细胞的标志物N-cadherin,vimentin与α-SMA蛋白的表达明显升高。以上结果说明经过LPS处理后,骨肉瘤细胞的上皮标志物消失同时间质细胞标志物升高,骨肉瘤细胞已经发生EMT。3、LPS诱导骨肉瘤发生EMT伴随TLR4表达升高TLR4是LPS的受体,那么在LPS诱导骨肉瘤细胞EMT过程中TLR4是否也参与其中。我们先在骨良性病变组织与骨肉瘤组织中分别检测了TLR4的表达。发现TLR4在骨肉瘤组织中的表达水平高于其在骨良性病变组织中的表达。同时TLR4与外科分期有关(p<0.05),我们通过Real-time RT-PCR与western blot检测了TLR4在骨肉瘤细胞系MG-63和Saos-2中表达变化。结果显示经过LPS诱导后,TLR4mRNA与蛋白的表达较对照组有显著升高,说明在LPS诱导骨肉瘤细胞发生EMT的过程中TLR4可能参与其中。4、LPS诱导骨肉瘤细胞EMT伴随lnc-HOTAIR表达升高为了明确LPS在促进骨肉瘤侵袭转移过程中是否伴随lnc-RNA的参与,我们检测了参与侵袭转移及EMT过程的lnc-RNA。在众多与侵袭转移相关的lnc-RNA中,LPS促进lnc-HOTAIR的作用最为显著。既往的研究表明,lnc-HOTAIR在肿瘤的侵袭迁移过程中发挥了重要的调控作用。我们的结果和之前的研究结果相同,说明lnc-HOTAIR作为重要的癌基因,在LPS促进骨肉瘤侵袭转移过程中可能发挥了非常重要的作用。5、lncRNA HOTAIR对骨肉瘤侵袭转移及EMT的影响为了验证lnc-HOTAIR在骨肉瘤中的作用,我们在组织学水平检测了lnc-HOTAIR的表达,发现lnc-HOTAIR在骨肉瘤组织中的表达高于其在骨良性病变组织中的表达,同时lnc-HOTAIR与外科分期及TNM分期有关(p<0.05),并且在骨肉瘤细胞中分别过表达lnc-HOTAIR以验证lnc-HOTAIR对EMT的影响。我们的研究结果发现过表达lnc-HOTAIR后骨肉瘤细胞侵袭和转移能力明显升高,同时过表达lnc-HOTAIR后骨肉瘤细胞发生EMT。6、LPS通过TLR4/HOTAIR调控骨肉瘤细胞EMT为了进一步验证TLR4与HOTAIR之间的关系,我们在骨肉瘤细胞中沉默HOTAIR的表达后加入LPS,结果提示LPS对骨肉瘤细胞的促侵袭转移作用明显减弱,但是仍然能够促进TLR4的表达。研究结果提示LPS促进骨肉瘤细胞的EMT以及侵袭转移是通过TLR4/HOTAIR来完成的。7、LPS通过p-ERK1/2信号通路抑制骨肉瘤发生EMT为了研究MAPK通路是否参与骨肉瘤细胞MG-63、Saos-2的EMT,我们收集并提取骨肉瘤细胞总蛋白,对MAPK通路的蛋白ERK1/2、p38MAPK、JNK的磷酸化情况分别进行检测。我们的结果证实,LPS在促进EMT过程中,伴随着MAPK ERK1/2的活化,但是LPS并没有影响P38以及JNK的表达。同时还发现p-ERK1/2在骨肉瘤组织中表达水平高于其在骨良性病变组织中的表达。8、LPS通过lncRNA HOTAIR活化p-ERK1/2信号通路为了验证LncRNA HOTAIR是否通过与炎症及肿瘤发生密切相关的MAPK信号通路传导通路发挥作用,在骨肉瘤细胞中沉默HOTAIR的表达后加入LPS,同时验证p-ERK1/2的蛋白表达情况。为进一步证明LPS的作用是通过p-ERK1/2的途径发挥的,我们在细胞培养过程中加入PD98059后,再给予LPS诱导,同时检测HOTAIR表达的变化。我们发现,ERK1/2活性被抑制后,LPS仍然能促进HOTAIR的表达。这一结果提示LPS促进骨肉瘤细胞的侵袭转移是通过HOTAIR/ERK1/2实现的。结论:我们的研究首次报道了LPS在骨肉瘤中对EMT的影响,同时证实其作用的机制是通过TLR4/lnc-HOTAIR/p-ERK1/2来实现的。我们的结果揭示了肿瘤微环境中的LPS对骨肉瘤侵袭转移的影响及其初步机制,为下一步骨肉瘤的治疗提供实验支持。