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目的：全身多器官进行性纤维化是系统性硬化症高死亡率的主要原因,其发病机制尚不清楚,目前无有效药物控制系统性硬化症纤维化的发展。促纤维化生长因子转化生长因子-β(TGF-p)/Smad信号通路活化是纤维化发生发展过程中的关键因素,因此,阻断TGF-β/Smad信号通路活化将是治疗系统性硬化症纤维化的重要靶点。虽然针对TGF-β/Smad信号通路进行抗纤维化治疗的实验研究展现出了良好的疗效,但将TGF-β拮抗剂用于系统性硬化症患者时并未发现明显的治疗效果,因此,迫切需要寻找新的途径阻断TGF-β/Smad信号通路。MicroRNAs (miRNAs)与靶基因3’端非翻译区(untranslated region, UTR)完全或不完全互补结合,通过诱导mRNA的降解或抑制其翻译从而调控靶基因的表达。miRNAs可通过调控TGF-β信号通路、细胞外基质结构蛋白、基质金属蛋白酶、结缔组织生长因子等纤维化相关基因的表达而促进或抑制纤维化。本研究在国内外首次对弥漫性和局限性系统性硬化症患者皮肤组织中的miRNA表达谱进行研究,筛选出与纤维化密切相关的miRNAs,探讨其在系统性硬化症纤维化发生发展过程中的作用及机制,为系统性硬化症的抗纤维化治疗提供新的思路和依据。方法：①收集7例系统性硬化症患者和7例正常对照者前臂皮肤组织,提取皮肤组织总RNA和蛋白质、制备冰冻切片和石蜡切片、分离培养皮肤原代成纤维细胞。将提取的总RNA进行miRNA芯片检测,并对差异表达的miRNAs进行生物信息学分析,筛选出与纤维化密切相关的miRNAs; Real-time PCR和原位杂交对筛选出的miRNAs在皮肤组织和成纤维细胞中进行验证；Real-time PCR和免疫组化分析皮肤组织和成纤维细胞中靶基因的表达变化。②TGF-β以不同浓度或不同时间刺激原代成纤维细胞,real-time PCI或western blot检测miRNAs或靶基因的表达变化,观察两者的变化趋势；使用miRNA模拟物或抑制剂调节miRNA的表达、构建含靶基因3’UTR区全长的荧光素酶报告基因载体等方法分析miRNA与靶基因的直接相互作用。③使用博来霉素诱导皮肤纤维化构建系统性硬化症小鼠模型,使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米抑制纤维化,HE染色观察小鼠皮肤纤维化的程度,real-time PCI或vestern blot检测miRNA或靶基因及纤维化基因的表达,分析三者的表达变化关系,初步探讨miRNA在整体动物中的作用及机制。结果：(一)通过对人皮肤组织进行miRNA表达谱和生物信息学分析,筛选出与纤维化密切相关的miRNAs。①与正常对照组相比较,弥漫性系统性硬化症患者皮肤组织中发生变化的miRNAs共42个,其中25个表达上调,17个表达下调。局限性系统性硬化症患者皮肤组织中发生变化的miRNAs共60个,其中42个表达上调,18个表达下调。在弥漫性与局限性系统性硬化症中表达均发生变化的miRNAs共21个,其中13个表达上调,8个表达下调。②采用real-time PCR在皮肤组织和原代成纤维细胞中验证发现：miR-21表达增高、miR-145和miR-29b的表达降低,与芯片结果一致。③生物信息学分析提示miR-21能与TGF-β信号通路中的负性调节蛋白Smad73’UTR结合,miR-145能与TGF-β信号通路中的正向调节蛋白Smad33’UTR结合,miR-29b能与Ⅰ型胶原(COL1A1)3’UTR结合。④Real-time PCR和免疫组化分析发现：Smad7在系统性硬化症皮肤组织及成纤维细胞中表达降低,Smad3表达增高。(二)在细胞水平探讨miR-21对纤维化的影响,研究其与靶基因Smad7的关系。①原代皮肤成纤维细胞经不同浓度或不同时间的TGF-β刺激后,miR-21和纤维化基因表达增加,Smad7表达降低,niR-21与Smad7的表达呈负相关。②miR-21过表达抑制Smad7的表达而miR-21表达下调则增加Smad7的表达,过表达miR-21促进纤维化基因的表达,miR-21表达下调则降低纤维化基因的表达；荧光素酶报告基因证实miR-21与Smad73’UTR存在直接相互作用。(三)在整体动物水平探讨miR-21对纤维化的影响及机制。①在博来霉素诱导的皮肤纤维化小鼠模型中,皮肤组织表现为胶原过度沉积,深层纤维化,血管壁明显增厚,炎性细胞浸润。使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗后,小鼠皮肤组织表现为真皮层变薄,纤维化程度降低。②在博来霉素诱导的皮肤纤维化小鼠模型中,皮肤组织中miR-21和纤维化相关基因表达明显增加,Smad7表达增加。使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗后,miR-21和纤维化相关基因表达降低,Smad7表达降低。本实验采用蛋白酶体抑制剂硼替佐米抑制纤维化,未使用miR-21的抑制剂直接抑制miR-21的表达,所以miR-21和Smad7的表达在整体动物水平受多种因素影响。结论：①系统性硬化症与正常对照者皮肤组织具有不同的miRNAs表达谱。②miR-21、miR-145和miR-29b可能通过调控其靶基因在系统性硬化症纤维化中发挥重要作用。③TGF-p能诱导miR-21的表达,miR-21通过抑制Smad7的表达强化TGF-β的促纤维化活性。④在博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化模型中,miR-21和纤维化相关基因表达增加,Smad7的表达增加。使用硼替佐米抑制纤维化后,miR-21和纤维化相关基因表达降低,Smad7的表达降低。