原发性干燥综合征（Primary Sj?gren’s syndrome,p SS）是一种系统性自身免疫性疾病,其典型特征是涎腺和泪腺的浆细胞性浸润。口干眼干是成人常见的症状,而腮腺肿胀在儿童中更为常见。虽然炎症主要存在于外分泌腺,随着疾病的发展也会逐渐累及其他器官,腺体外表现可能包括关节炎、雷诺氏现象、紫癜、肺部疾病、肾脏疾病和神经系统受累。该病最常见于中年女性,患病率约为0.1-3%,成年人中每10万人的发病率每年3.9-5.3。遗传、激素和环境因素共同导致疾病发展。B细胞过度活跃、自身抗体的产生以及异位生发中心的形成是p SS的主要病理特征。在唾液腺和泪腺中可检测到涉及自身免疫过程的关键细胞因子,由上皮细胞表达的CXCL13就是一种调节B细胞迁移的趋化因子,在几种自身免疫性疾病中表达升高并与疾病的严重程度有关,此外,CXCL13的过表达增加了主要由B细胞组成的异位生发中心的形成,提示CXCL13可能趋化B细胞进入病变的唾液腺。在p SS的免疫发病机制中主要由浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell,p DC）合成的IFN-α也引起越来越多关注,其可通过激活下游的信号通路在类风湿关节炎,系统性红斑狼疮,炎症性肠病等自身免疫疾病中起着重要作用。目前临床对于p SS的治疗缺少安全有效的药物。CP-25（苯磺酰芍药苷,Phenylsulfonylpaeoniflorin,代号CP-25）是芍药苷（Paeoniflorin,Pae）经酯化修饰得到的单一成分,脂溶性和口服生物利用度均明显提高。在前期研究中,我们通过建立颌下腺（salivary gland,SG）蛋白诱导型实验性干燥综合征（experimental Sj?gren’s syndrome,ESS）小鼠模型,证实了CP-25对ESS小鼠模型有一定的疗效,且可能是通过影响B细胞上CXCR5-GRK2-MAPK信号通路而发挥作用。本课题着重关注在IFN-α刺激下,能否通过激活颌下腺上皮细胞（salivary gland epithelial cells,SGECs）上JAK-STAT信号通路而增加炎症因子CXCL13的分泌,从而与B细胞上CXCL13的特异性受体CXCR5结合而影响B细胞向炎症组织中的迁移。及CP-25是否能通过调节GRK2与JAK1的结合,抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信号通路的激活达到治疗ESS的目的,为今后CP-25能够应用于临床提供实验依据。目的:1. 通过建立ESS小鼠模型,观察CP-25对ESS小鼠模型的治疗作用及CP-25对ESS小鼠B细胞亚群的调控作用。阐明CP-25可能通过调节颌下腺组织上JAK1-STAT1/2-CXCL13信号通路对B细胞功能产生影响。2. 观察IFN-α-JAK1-STAT1/2-CXCL13信号通路以及B细胞亚群在p SS患者唇腺组织和血液样本中的表达。3.观察CP-25对HSGECs中JAK1-STAT1/2-CXCL13信号通路的作用以及其对B细胞迁移功能的影响,阐明CP-25可能通过影响HSGECs上GRK2-JAK1的结合调节该条信号通路改善B细胞功能。方法:方法一:建立ESS动物模型。本研究通过SG蛋白诱导建立ESS小鼠模型,分为正常组、模型组、CP-25（35mg/kg、70mg/kg）给药组、羟氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）（80mg/kg）给药组,每组10只。造模过程中观察小鼠全身表现,记录小鼠每周体重;检测小鼠唾液量;处死小鼠后,H&E染色法观察颌下腺淋巴细胞浸润情况;收集小鼠脾脏,胸腺,颌下腺检测器官指数;提取胸腺T淋巴细胞和脾脏B淋巴细胞,CCK8法检测细胞活力;流式细胞术检测小鼠外周血和颌下腺中B细胞亚群比例;Western blot法检测小鼠颌下腺中JAK1-STAT1/2信号通路蛋白表达;酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血清中CXCL13的表达;激光共聚焦法检测小鼠颌下腺组织中CXCL13表达。方法二:收取临床样本。本研究收集人的外周血与唇腺组织样本,细胞流式术检测外周血中B细胞亚群比例;激光共聚焦法检测人唇腺组织中JAK1-STAT1信号通路蛋白、CXCL13的表达。免疫组化法检测人唇腺组织中IFN-α蛋白的表达。方法三:建立体外细胞模型。本研究选择人颌下腺上皮细胞（Human salivary gland epithelial cells,HSGECs）作为体外研究p SS的模型,检测IFN-α刺激下,采用激光共聚焦法、ELISA法、RT-PCR法检测CXCL13在HSGECs上的表达;Western blot法检测JAK1-STAT1/2信号通路蛋白在HSGECs上的表达;Transwell法检测HSGECs与B淋巴细胞共培养后B细胞迁移能力的变化;免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation,CO-IP）和激光共聚焦法检测GRK2与JAK1的共表达。结果:成功建立SG蛋白诱导型ESS小鼠模型,ESS模型组小鼠唾液量减少,颌下腺组织淋巴细胞浸润程度增加,颌下腺指数、脾脏指数升高,脾脏B淋巴细胞的增殖活力明显增加。CP-25（35、70mg/kg）治疗组和HCQ（80mg/kg）治疗组可增加小鼠唾液量的分泌,减少淋巴细胞浸润程度,降低脾脏B淋巴细胞的增殖活力;CP-25（70mg/kg）治疗组可降低小鼠的脾脏指数与颌下腺指数,HCQ（80mg/kg）治疗组仅降低小鼠的颌下腺指数。在小鼠外周血中,ESS模型组小鼠中总B细胞（CD19⁺）和CXCR5⁺B细胞的百分比增加,记忆B细胞（CD27⁺CD19⁺）的百分比降低。CP-25（35、70mg/kg）治疗组和HCQ（80mg/kg）治疗组可降低总B细胞（CD19⁺）和CXCR5⁺B细胞在外周血中的比例,升高记忆B细胞（CD27⁺CD19⁺）在外周血中的比例。在小鼠颌下腺中,ESS模型组小鼠中总B细胞（CD19⁺）,CXCR5⁺B细胞,记忆B细胞（CD27⁺CD19⁺）的百分比增加,而CP-25（35、70mg/kg）治疗组和HCQ（80mg/kg）治疗组可降低总B细胞（CD19⁺）,记忆B细胞（CD27⁺CD19⁺）和CXCR5⁺B细胞在颌下腺中的比例。ESS小鼠颌下腺中p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2、CXCL13蛋白表达升高,ESS小鼠血清中CXCL13表达升高,CP-25（70mg/kg）治疗组和HCQ（80mg/kg）治疗组可降低颌下腺中p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2蛋白的表达,CP-25（35、70mg/kg）治疗组可降低颌下腺和血清中CXCL13的表达。选取临床标本检测相关指标,人唇腺组织H&E染色结果显示,与正常人相比,p SS患者唇腺组织中淋巴细胞浸润严重且有明显的浸润灶的形成。人唇腺组织激光共聚焦结果显示,与正常人相比,p SS患者唇腺组织中CXCL13在唾液腺上皮细胞上的表达升高,IFN-α、p-JAK1和p-STAT1蛋白表达升高。人外周血流式结果显示,与正常人相比,p SS患者外周血中总B细胞（CD19⁺）和CXCR5⁺B细胞的百分比增加而记忆B细胞（CD27⁺CD19⁺）的百分比降低。在HSGECs中,IFN-α（10ng/ml）刺激组CXCL13、p-JAK1、p-STAT1和p-STAT2蛋白的表达明显升高,CP-25(10^-7mol/l、10^-6mol/l、10^-5mol/l)给药组可降低CXCL13的表达。CP-25(10^-5mol/l)给药组和Tofacitinib（TOF）（0.1μM、1μM、10μM）给药组可降低p-JAK1、p-STAT1和p-STAT2蛋白表达。将HSGECs与B细胞共培养后,Transwell结果显示,IFN-α刺激HSGECs后与B细胞共培养,结果显示B细胞迁移数量明显增加。CP-25(10^-6mol/l、10^-5mol/l)给药组,TOF（10μM）给药组和CXCL13抑制剂组（CXCL13中和抗体）可降低B细胞迁移数量。激光共聚焦和CO-IP结果显示,HSGECs细胞中存在GRK2和JAK1的共表达,IFN-α刺激后,GRK2与JAK1共表达下降,CP-25(10^-5mol/l)给药后GRK2与JAK1共表达升高。结论:1.CP-25通过调节B细胞亚群比例及B细胞增殖能力发挥对SG抗原诱导型ESS小鼠模型的治疗作用。2. p SS患者外周血中B细胞亚群比例异常和相关蛋白表达情况与ESS小鼠模型结果一致。其中总B细胞和CXCR5⁺B细胞比例升高,记忆B细胞比例下降;唇腺组织中IFN-α、CXCL13表达升高,JAK-STAT通路被激活。3. CP-25可能通过上调HSGECs中JAK1-GRK2的结合,抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13信号通路的激活,减少CXCL13的表达而降低B细胞的迁移能力,达到治疗p SS的目的。