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目的:宫颈癌(cervical cancer)是世界范围内发病率最高、最常见的妇科恶性肿瘤之一,传统的手术治疗和化学疗法都有很严重的副作用且不能达到理想的疗效。小干扰RNA(siRNA)是一种常见的基因沉默技术,其通过引入内源性或外源性的双链RNA触发同源mRNA的降解,从而沉默目标基因的表达。递送siBcl-2可以特异性地下调Bcl-2蛋白的表达并诱导癌细胞凋亡,从而起到基因治疗的作用。本课题使用阳离子脂质体(liposomes;lip)作为基础载体,使用合成的透明质酸(HA)与叶酸(FA)聚合物(HA-FA)进行包覆,得到具有双重靶向作用的纳米载体(HA-FA-Lip)。改善阳离子脂质体作为基因载体的缺陷并改善其递送效率,保持其在血液循环中的稳定,并通过EPR(enhanced permeability and retention)效应增加其在肿瘤部位的蓄积。双靶头脂质体可以特异性靶向宫颈癌细胞(Hela细胞)表面的CD44受体和FA受体,增加Hela细胞对脂质体的摄取。阳离子脂质体与内涵体膜作用,结构破坏性质改变并释放siBcl-2,然后特异性下调Bcl-2蛋白的表达,诱导Hela细胞凋亡,达到基因治疗宫颈癌的效果。方法:(1)制备得到HA-FA聚合物并进行核磁氢谱和红外光谱的表征。(2)对Lip、HA-Lip和HA-FA-Lip纳米粒进行粒径和电位的表征,使用透射电子显微镜(TEM)观察纳米粒的形态。(3)考察各组纳米粒对siRNA的吸附效率和保护性,并通过MTT、血清稳定性、蛋白吸附实验考察各组载体的安全性。(4)通过共聚焦显微镜和流式细胞术,使用Hela细胞为细胞模型,考察体外细胞对各组载基因纳米粒的摄取情况,以及各组载基因纳米粒在细胞内的定位;通过Western blot实验筛选有效的siBcl-2序列并考察各组载基因纳米粒对Hela细胞的体外转染效率。(5)通过小动物三维活体成像技术考察CD44受体单靶向及CD44受体和叶酸受体双靶向纳米载体的体内靶向性。(6)建立小鼠皮下荷瘤模型,通过Western blot实验考察不同给药治疗之后小鼠肿瘤组织的Bcl-2蛋白水平下降效率;通过TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测各组小鼠肿瘤组织的细胞凋亡水平,并考察各组载体的体内安全性。结果:(1)成功制备了 HA-FA聚合物,淡黄色,水溶性良好。(2)Lip、HA-Lip和 HA-FA-Lip 的粒径分别为 67.6、130.6 和 125.6nm,电位分别为+40.8、-22.6 和-22.4mv。TEM结果显示纳米粒形态圆整、分布均匀。(3)Lip与siRNA的最佳N/P比为6:1,且后续包覆材料的吸附不会造成siRNA的泄露。血清稳定性、蛋白吸附及细胞毒性实验证明HA和HA-FA的包覆能够屏蔽Lip的正电荷,提高载体的安全性,降低细胞毒性。(4)流式细胞术结果表明相较于HA单靶头载体,HA-FA包覆的双靶头载体能够明显增加Hela细胞对siRNA的摄取;共聚焦显微镜结果显示HA-FA-Lip/siRNAFAM在 Hela细胞内的共定位多于 Lip/siRNAFAM组及HA-Lip/siRNAFAM组:Western blot实验结果表明各组基因载体可以将siRNA高效地递送至Hela细胞并下调Bcl-2蛋白的表达,并用TUNEL凋亡试剂盒检测出HA-FA-Lip/siBcl-2FAM 诱导的 Hela 细胞凋亡高于 Lip/siBcl-2FAM组及HA-Lip/siBcl-2FAM组。(5)纳米粒可以较好的靶向到小鼠皮下肿瘤,HA-FA-Lip双靶组的靶向性高于HA-Lip单靶头组。(6)优势治疗组(HA-FA-Lip/siRNAFAM)对荷瘤小鼠肿瘤组织的Bcl-2蛋白水平相较于单靶头组和生理盐水组明显下降,肿瘤组织细胞凋亡明显增加,而且治疗后各组小鼠的主要器官均未出现明显病理变化。结论:本课题构建的HA-FA-Lip/siBcl-2双靶头基因纳米粒相较于普通的单靶头纳米粒具有更好的肿瘤靶向性,使纳米粒更多地蓄积在肿瘤组织,释放siBcl-2,下调Bcl-2蛋白表达,诱导Hela细胞凋亡,达到基因治疗的效果。