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苯丙氨酸羟化酶(Phenylalanine hydroxylase,PAH,EC 1.14.16.1)是一种芳香族氨基酸羟化酶(Aromatic amino acid hydroxylase,AAAH),能催化苯丙氨酸单加氧生成酪氨酸。紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)来源的苯丙氨酸羟化酶(CvPAH)的结构与人类苯丙氨酸羟化酶(HuPAH)亚基结构高度相似,催化性能相近,在人体生理温度、pH条件下表现出较高的酶活,在治疗苯丙酮尿症中具有潜在应用价值。然而,目前CvPAH的热稳定性较低,不利于长期保存,限制了该酶的应用。因此,提高CvPAH的热稳定性、存储稳定性,为其在功能食品领域的应用打下坚实的基础。本论文对紫色色杆菌来源的苯丙氨酸羟化酶进行基因水平的设计,研究了N-端柔性区对CvPAH酶学性质的研究,并且对CvPAH进行分子改造,提高其热稳定性。在此基础上,研究了保护剂对CvPAH热稳定性的保护效果。具体研究结果如下:(1)通过高斯网络模型预测发现苯丙氨酸羟化酶N-端前10个氨基酸为一段柔性很大的无规则区域,为了研究该段序列对酶热稳定性的影响,对该段氨基酸进行截断或重组,获得CvPAH、N-7、N-8、N-9、N-10以及CvPAH+T7 tag。最适反应温度研究表明,各酶的最适反应温度均为40℃,相较其他截断酶及原酶,N-9、CvPAH+T7tag的热稳定性有所提高。而对最适反应pH进行研究,发现添加T7 tag能使酶的最适pH向酸性偏移,最适反应pH达到7.5。在pH 7.5、37℃条件下对各酶进行酶活测定发现,重组CvPAH+T7 tag具有更高的活性562.7 U·mg-1。相较原酶酶活(377.23 U·mg-1),二者酶活均显著提高。(2)对CvPAH+T7 tag进行进一步分子改造。根据嗜热菌蛋白存在Ala替换Gly以及Arg替换Lys的趋势。将重组CvPAH中所有Gly突变成Ala、Lys突变成Arg。结果表明,突变酶K94R和G221A在50℃的半衰期分别为26.2 min、16.8 min,比重组CvPAH(9.0 min)分别提高了1.9倍、0.9倍,同时组合突变酶K94R/G221A在50℃处理1 h后仍保留65.6%的酶活,比重组CvPAH(8.6%)高出6.6倍。圆二色谱结果显示重组CvPAH和突变酶K94R、G221A及K94R/G221A的Tm值分别为51.5℃、53.8℃、53.1℃、54.8℃。(3)考察了多种保护剂对重组CvPAH热稳定性的影响,结果表明,甘油、甘露醇、棉籽糖、海藻糖提高重组CvPAH的热稳定性的效果显著。对海藻糖,棉籽糖,甘露醇进行正交实验,获得最佳保护剂配方(2.5 mmol·L-1甘露醇、1 mmol·L-1棉籽糖、1.5mmol·L-1海藻糖)。在此复合保护剂作用下50℃处理10 min后酶活保留率高达到99.3%。在4℃、20℃下,添加10%甘油、复合保护剂相较对照组均表现出更好的保护作用;在37℃下,通过添加10%甘油、复合保护剂,半衰期较对照组分别提高了2.8倍、4.0倍。