WT161在视网膜母细胞瘤和骨肉瘤中的作用及其机制研究

来源 :江西中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hobbycui
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目的:本研究在体内和体外水平上观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161对视网膜母细胞瘤细胞和骨肉瘤细胞的作用,并探讨了WT161对视网膜母细胞瘤细胞和骨肉瘤细胞作用的主要机制。方法:1.体外实验:(1)采用MTT方法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161对视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞增殖能力的影响。(2)分别采用软琼脂糖克隆形成实验和平板克隆实验进一步检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161对视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞增殖能力的影响。(3)ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161诱导视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞凋亡的作用。(4)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测视网膜母细胞瘤细胞中Bcl-2促凋亡家族成员Bad、Bim、Bax、Noxa的m RNA表达量。(5)荧光素酶报告实验检测视网膜母细胞瘤细胞中蛋白Bad的转录活性。(6)采用染色质免疫沉淀法(Ch IP)检测视网膜母细胞瘤细胞中蛋白Bad启动子上组蛋白H3和H4的乙酰化水平。(7)蛋白质印迹法(Western Blot)检测视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞中蛋白α-tubulin、Acetyl-α-tubulin、PARP、Cleaved-PARP、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、PTEN、Akt、P-Akt的表达量。(8)采用MTT方法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161和临床化疗药物顺铂、5-氟脲嘧啶(5-FU)分别在视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞中联合使用时,各实验组的相对细胞数,再使用Compu Syn软件计算WT161和临床化疗药物的协同效率。2.体内实验:选取24只BALB/c雌性裸鼠,进行适应性培养。约一周后,裸鼠皮下接种骨肉瘤细胞,每只接种1-3×10~6个骨肉瘤细胞,确保每只裸鼠接种细胞数一致。皮下接种细胞后,每天观察裸鼠的状况以及造模是否成功,期间要给裸鼠给予充足的饲料与水。造模成功后,将裸鼠随机分成4组,每组6只,进行给药。第一组对照组裸鼠,腹腔注射10%DMSO+90%无菌PBS,一天一次;第二组WT161给药组裸鼠,腹腔注射WT161,剂量为80mg/kg,一天一次;第三组5-FU给药组裸鼠,腹腔注射5-FU,剂量为5mg/kg,一周三次第四组WT161&5-FU联合给药组,腹腔注射WT161与5-FU,剂量分别为80mg/kg和5mg/kg,频率分别为一天一次和一周三次。在连续给药期间,每三天使用游标卡尺测量肿瘤,肿瘤体积计算公式=0.5×肿瘤长度×(肿瘤宽度)~2。给药两周后,对裸鼠进行安乐死。取出肿瘤,称重,计算肿瘤体积。结果:1.(1)MTT方法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161对骨肉瘤和视网膜母细胞瘤细胞增殖能力的影响:与对照组相比,不同浓度的WT161对骨肉瘤和视网膜母细胞瘤细胞的增殖能力具有抑制作用且随着浓度的增加抑制率越来越大,具有显著性差异(P<0.01)。(2)采用软琼脂糖克隆形成实验和平板克隆实验进一步检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161对视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞增殖能力的影响:与对照组相比,不同浓度的WT161实验组的视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞集落形成能力被抑制,具有显著性差异(P<0.01)。(3)ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161诱导骨肉瘤和视网膜母细胞瘤细胞凋亡的作用:与对照组比较,不同浓度的WT161会诱导骨肉瘤和视网膜母细胞瘤细胞凋亡且随着浓度的增加凋亡率越来越大,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)RT-PCR检测视网膜母细胞瘤细胞中Bcl-2促凋亡家族成员Bad、Bim、Bax、Noxa的m RNA表达量:与对照组比较,给药组中蛋白Bad、Bim、Bax、Noxa m RNA表达均有不同程度的增加,其中蛋白Bad m RNA的增加最为显著,具有显著性差异(P<0.01)。(5)荧光素酶报告实验检测视网膜母细胞瘤细胞中蛋白Bad的转录活性:与对照组比较,给药组中蛋白Bad的转录活性明显增加,具有显著性差异(P<0.05)。(6)染色质免疫沉淀法(Ch IP)检测视网膜母细胞瘤细胞中Bad蛋白启动子上组蛋白H3和H4的乙酰化水平:与对照组比较,给药组中Bad蛋白启动子上组蛋白H3和H4的乙酰化水平增加,具有显著性差异(P<0.01)。(7)蛋白免疫印迹法(Western blot)检测骨肉瘤和视网膜母细胞瘤细胞蛋白α-tubulin、Acetyl-α-tubulin、PARP、Cleaved-PARP、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、PTEN、Akt、P-Akt的表达量:与对照组比较,给药组中蛋白PARP、Caspase-3、P-Akt的表达量降低;蛋白Acetyl-α-tubulin、Cleaved-PARP、Cleaved-caspase-3、PTEN的表达量增加,且都具有显著性差异(P<0.05);蛋白α-tubulin与Akt的表达量与对照组相比,基本没有变化。(8)Compu Syn软件计算组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161和临床化疗药物顺铂、5-FU的协同效率:WT161和顺铂在视网膜母细胞瘤细胞中的CI值,与5-FU在骨肉瘤细胞中的CI值大多数都小于1。2.体内实验中选取了24只BALB/c雌性裸鼠,构建了骨肉瘤细胞移植瘤模型,在连续给药两周后,取出肿瘤后发现:与对照组小鼠相比,WT161给药组、5-FU给药组和WT161&5-FU联合给药组的肿瘤大小和重量都有不同程度的减小。此外,与WT161给药组和5-FU给药组相比,WT161&5-FU联合给药组的肿瘤大小和肿瘤也有显著减小。结论:1、组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161抑制视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞的增殖,诱导视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞的凋亡。2、组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161会与临床化疗药物顺铂协同杀伤视网膜母细胞瘤细胞,会与临床化疗药物5-FU协同杀伤骨肉瘤细胞。3、组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161主要通过增加蛋白Bad的表达来增加视网膜母细胞瘤细胞的凋亡。4、组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161主要通过调节PTEN/Akt信号通路来增加骨肉瘤细胞的凋亡。5、通过体内实验研究得出,组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161和临床化疗药物5-FU都会抑制骨肉瘤移植瘤的生长,此外在体内联合使用WT161和5-FU也会协同抑制骨肉瘤移植瘤的生长。6、通过体内和体外实验分析得出组蛋白去乙酰化酶抑制剂WT161对视网膜母细胞瘤和骨肉瘤都具有抗肿瘤活性,是一个具有潜在价值的抗青少年肿瘤的药物。
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