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目前缺乏针对人类表皮生长因子受体2阳性(HER2+)和三阴性(TNBC)乳腺癌的治疗药物,导致这两种雌激素受体阴性(ER-)乳腺癌的死亡率居高不下。他莫昔芬(TAM)是目前使用最广泛的选择性靶向雌激素受体药物,在临床中常被用于雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌的辅助治疗以及乳腺癌发病高危女性的预防性治疗。然而,由于其在临床上主要用于ER+乳腺癌患者的治疗以及大多数患者在使用后会出现耐药性等问题,其应用范围大大受限。1,25-二羟基维生素D3(1,25D)作为首个被发现的人体内生物活性最高的维生素D代谢物,能调节包括ER-乳腺癌在内的多种乳腺癌细胞周期与凋亡,并抑制雌激素的合成与活性。因此,为探究1,25-二羟基维生素D3与他莫昔芬联用对ER-乳腺癌细胞作用,本实验通过HER2+乳腺癌细胞系SK-BR-3和三阴性乳腺癌细胞系HCC1806进行体外和体内实验,探究1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对ER-乳腺癌的细胞增殖、周期、凋亡及其相关分子机制和肿瘤生长的作用。得出的主要结论如下:(1)运用活细胞计数、CCK-8增殖实验和细胞表型三种实验方法,分析1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对SK-BR-3和HCC1806两种乳腺癌细胞的细胞增殖的作用。结果发现,5μM的1,25-二羟基维生素D3和5μM的他莫昔芬单独使用对两种细胞增殖均无显著作用,而两者联合能显著降低HCC1806活细胞的数目,但导致SK-BR-3活细胞数目的上升。说明1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对于不同亚型乳腺癌细胞的细胞增殖作用存在差异。(2)使用流式细胞术检测药物处理后细胞周期和凋亡率的变化,并通过蛋白免疫印迹法分析周期相关蛋白p21、p27和凋亡相关蛋白PARP、Bcl-2、p53、Caspase3、Caspase6、Caspase9的表达水平,以探究1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对两种细胞增殖的差异作用是否与细胞周期和凋亡变化相关。结果表明,1,25-二羟基维生素D3和他莫昔芬联合后并不引起两种细胞的细胞周期阻滞和周期相关蛋白p21、p27的表达水平变化;两者联合对于SK-BR-3细胞的凋亡率和上述凋亡相关蛋白的表达也无显著影响,但会诱导HCC1806细胞凋亡率显著增加,Caspase3、Caspase6和p53蛋白的表达水平显著下降,引起PARP蛋白的剪切条带增强。表明1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对SK-BR-3和HCC1806细胞周期无影响,但能促进HCC1806细胞凋亡。(3)使用蛋白降解抑制剂进行干预,通过CCK8和蛋白免疫印迹法探究1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对SK-BR-3和HCC1806细胞凋亡的差异作用是否与p53蛋白的降解有关。结果发现,使用蛋白降解抑制剂抑制两种细胞中p53蛋白的降解后,1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对SK-BR-3和HCC1806细胞的活细胞数目无显著影响。说明1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对两种细胞凋亡的差异作用均不依赖于p53蛋白的降解途径。(4)使用AKT磷酸化抑制剂抑制AKT的磷酸化,并通过细胞计数、蛋白免疫印迹法,流式细胞术探究1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬在SK-BR-3细胞中引起的他莫昔芬敏感性下降是否依赖于AKT磷酸化。结果发现,1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬会引起SK-BR-3中AKT磷酸化水平升高;而AKT磷酸化抑制剂处理后,SK-BR-3活细胞数显著下降,PARP活性剪切条带及总凋亡率增加,Bcl-2表达水平下降。说明在SK-BR-3细胞中,1,25-二羟基维生素D3和他莫昔芬联合使用导致他莫昔芬敏感性下降的原因与AKT的磷酸化上升有关,且该过程具有AKT磷酸化依赖性。(5)通过蛋白免疫印迹法、免疫组化实验探究1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对HCC1806构建的移植瘤模型的影响。结果发现,1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬能显著抑制小鼠体内肿瘤的生长;同时肿瘤组织中Ki67、p53和Bcl-2的表达水平也显著下降,PARP活性剪切条带表达增强。表明1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬能够抑制体内肿瘤的生长,促进瘤体中癌细胞的凋亡。综上,本实验结果表明1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬对于不同的ER-乳腺癌细胞作用存在差异。1,25-二羟基维生素D3联合他莫昔芬能导致SK-BR-3的耐药性增加,且该过程依赖于AKT的磷酸化活化。但两者联合能抑制HCC1806细胞在体内和体外的生长,通过增强PARP蛋白活性剪切形式及抑制Bcl-2蛋白的表达促进其凋亡。这些结果可为功能食品辅助化疗药物治疗不同亚型乳腺癌患者提供借鉴。